OETDK.

Az elektromos és hibrid járművek terjedésével egyre nagyobb figyelem irányul a működésük során keletkező elektromágneses térre, mivel ez hatással lehet mind a környezetre, mind az emberi egészségre. Az ilyen járművek elektromotorjai és akkumulátorai erőteljes mágneses mezőt generálnak. A mágneses terek vizsgálata nemcsak a járművek működésének optimalizálása szempontjából fontos, hanem annak érdekében is, hogy biztosítsuk a biztonságos és egészséges környezetet az autókat használók számára.Célunk az elektromotorral működő autók mágneses tereinek mérése, valamint az árnyékolási lehetőségek kutatása volt.Vizsgálatunk során egy elektromágneses sugárzásmérőt, az ET825 típusú eszközt használtuk, és összesen 14 járművet mértünk. Az autók belső terében 13 különböző ponton végeztünk méréseket: anyósülés, láb- és fejtámasz; hátsó bal ülés, láb- és fejtámasz; hátsó középső ülés, láb- és fejtámasz; hátsó jobb ülés, láb- és fejtámasz; valamint az elülső középkonzol. A méréseket két különböző sebességnél végeztük: 30–50 km/h és 100–110 km/h sebességtartományban. A mágneses tér csökkentésére végzett árnyékolási tesztek során permalloy fóliát és acéllemezt alkalmaztunk. Az adatokat MATLAB környezetben elemeztük.Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy magasabb sebességnél a belső mágneses tér jelentősen növekszik. A legnagyobb mágneses mezőt a legtöbb esetben a hátsó bal láb- és ülésrészen, valamint a hátsó középső ülés láb- és ülésrészein mértük. Az autók többségénél a mért érték kevesebb mint 10 mikrotesla (µT) volt, amely a lakosság számára meghatározott megengedett határérték alatt helyezkedik el. A jelenlegi nemzetközi szabványok szerint az elektromágneses tér biztonságos határértéke a lakosság számára 100 µT. Az árnyékolás alkalmazása a mérhető mágneses tér erősségét a permalloy esetében körülbelül 30%-kal, az acéllemez esetében mintegy 50%-kal csökkentette.Eredményeink alapján tehát megállapítható, hogy a vizsgált autók mágneses tere nem haladja meg a biztonságos határértékeket. Ez arra utal, hogy az elektromos és hibrid járművek belső környezete az egészségre vonatkozó szabványoknak megfelelően biztonságos. Az árnyékolási technológiák alkalmazása – bár hatékony – nem szükséges a szabványok betartásához, de a mágneses terek további csökkentésére irányuló kutatások segíthetnek az optimális biztonsági szintek elérésében.

Témavezető: Dr. Béresová Monika

A membránok molekuláris rendezettségének mértéke jelentős mértékben befolyásolja a bennük található transzmembrán fehérjék szerkezetét és aktivitását, ezáltal pedig a különböző sejtfunkciókat is. A membránok szerveződésének leírása élő sejtekben elsősorban fluoreszcencia alapú módszerekkel és környezeti paraméterekre érzékeny fluorofórokkal lehetséges, amelyek eltérő aspektusból jellemzik a kettősrétegek szerkezetét. Bár az irodalomban általánosságban az ezen próbák által hordozott információt ekvivalensként kezelik, korábbi munkánk során kimutattuk, hogy azok valójában a membránok eltérő mélységben elhelyezkedő rétegeit karakterizálják. A leggyakrabban alkalmazott polaritásra, azaz a membrán hidrofobicitására érzékeny próba, a Laurdan, illetve annak spektrális eltolódását jellemző generalizált polarizációja elsősorban a membrán belső, hidrofób rétegeit jellemzi. A Laurdan kedvezőtlen spektrális tulajdonságai miatt a festék alternatívájaként gyakran használják a di-4-ANEPPDHQ-t, amely generalizált polarizációjának részletes, mélységi elemzése még nem történt meg.Munkánk során célunk annak vizsgálata, hogy a di-4-ANEPPDHQ generalizált polarizációja a membránok mely rétegeinek molekuláris rendezettségét karakterizálja. Ennek vizsgálatához CHO sejteket kezeltünk különféle szterolok (koleszterin, 7-dehidrokoleszterin és 6-ketokolesztanol) metil-béta-ciklodextrinnel alkotott komplexeivel, amelyekről korábban bebizonyítottuk, hogy eltérő módon befolyásolják a rendezettséget a membrán különböző rétegeiben. Ezután megvizsgáltuk a kezeléseknek a di-4-ANEPPDHQ generalizált polarizációjára gyakorolt hatásait.Kísérleteink során mind spektrofluorimetria, mind pedig konfokális mikroszkópia során azt találtuk, hogy a szterolok eltérő hatékonysággal növelték a di-4-ANEPPDHQ generalizált polarizációjának mértékét, azaz a membrán molekuláris rendezettségét. A leghatékonyabb szterolnak a 6-ketokolesztanol bizonyult, míg a legkisebb növekedést a 7-dehidrokoleszterin okozta. Eredményeink jelentősen eltértek a korábban a Laurdan vizsgálata során nyert adatoktól és összességében arra utalnak, hogy a di-4-ANEPPDHQ a Laurdantól eltérő módon sokkal inkább a membrán határfelülethez közelebbi, alacsonyabb mélységű rétegeinek szerveződéséról szolgáltat információt. Ezáltal a di-4-ANEPPDHQ-val nyert eredmények sokkal inkább kiegészítik a Laurdan-nal kapott adatokat, mintsem azok alternatívájának tekinthetők.EKÖP-25-2-DE-337, OTKA FK143400, FK146740, STARTING 153195

Témavezető: Dr. Kovács Tamás és Dr. Zákány Florina

Az emlőtumorok kb. 20%-ában megfigyelhető az ErbB2 (HER2) fokozott expressziója, amely jellemzően a betegség rossz prognózisával társul. Ezen tumorok terápiájában a hagyományos, általában sok mellékhatással járó kemoterápiás szerek mellett elterjedten alkalmazzák a trastuzumabot, egy ErbB2-ellenes monoklonális antitestet, amely célzottan a tumorsejteket támadja. A kétféle megközelítés kombinációjának tekinthető a trastuzumab emtansine (T-DM1), amely egy trastumab antitestet és egy mikrotubulusokat gátló szert (DM1) tartalmazó konjugátum, azaz ötvözi a hatékony citotoxicitás és a célzott alkalmazás előnyeit. Hátránya, hogy endocitózis után a daganatos sejtben a DM1 komponensnek le kell hasadnia és ki kell jutnia a lizoszómákból az igazán magas hatékonyság érdekében, ami sok esetben a terápiás hatás limitáló tényezője. Mivel különféle molekulák sejtbe jutása, illetve lizoszómális kiszabadulása fokozható a membránok összetételének, elsősorban koleszterintartalmának módosításával, célunk annak vizsgálata volt, hogy a T-DM1 terápiás hatékonysága fokozható-e a membránok koleszterintartalmának csökkentésével. Ehhez ErbB2 fehérjét túlexpresszáló SKBR-3 sejteket előkezeltünk atorvastatinnal, illetve annak alternatívájaképpen egy újonnan leírt, 24-dehidrokoleszterol-reduktázt (DHCR24) gátló szintetikus szterolanalóggal, az SH42-vel, majd tanulmányoztuk a plazmamembrán és a lizoszómális membránok biofizikai tulajdonságait egy környezeti paraméterekre szenzitív fluorofór, az F66 és konfokális mikroszkópia alkalmazásával, illetve a T-DM1 proliferációra kifejtett hatását áramlási citometriával. Kísérleteink során mind az atorvastatin, mind pedig az SH42 szignifikánsan lecsökkentette a dipólpotenciál nagyságát mind a sejtek plazmamembránjában, mind pedig lizoszómális membránjaiban. Ezek mellett mindkét koleszterincsökkentő kezelés fokozta a T-DM1 emlőtumoros sejtek proliferációját gátló hatását, ugyanis mindkét vegyület hatására balra tolódott a T-DM1 dózis-hatás görbéje. Figyelemre méltó módon az SH42 által okozott változások mértéke szignifikánsan nagyobbnak bizonyult, mint az atorvastatin esetén. Eredményeink alapján a koleszterincsökkentő szerek kedvezően befolyásolhatják a T-DM1 terápiás hatékonyságát, feltételezéseink szerint azáltal, hogy a membránok biofizikai tulajdonságainak kedvező módon történő befolyásolása által fokozhatják annak sejtbe jutását, illetve az aktív DM1 lizoszómális kiszabadulását.OTKA FK143400, STARTING 153195, OTKA FK146740

Témavezető: Dr. Kovács Tamás és Dr. Zákány Florina

BevezetésKorábbi vizsgálataink igazolták, hogy az interleukin-2 intrakrin módon is közvetíthet jelátvitelt, vagyis a ligandum sejtorganellumokban is kötődhet receptorához. Hasonló mechanizmust feltételezünk az epidermális növekedési faktor (EGF) és receptora (EGFR) esetében is. Mivel a prekurzor EGF ADAM-proteázok hasítása révén válik szolubilis ligandummá, az intracelluláris hasítás és kötődés az EGFR intrakrin működésére utalhat. Ennek feltárása hozzájárulhat a célzott daganatellenes terápiák fejlesztéséhez.CélkitűzésCélunk egy ADAM17-et kódoló plazmid, valamint egy fluoreszcensen jelölt preEGF-et hordozó CHO sejtvonal létrehozása volt. Feltételeztük, hogy az ADAM-17 által hasított preEGF intracellulárisan kötődik az EGFR-hez. Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópiával (FCS) vizsgáltuk, megjelenik-e szolubilis EGF (sEGF), illetve változik-e az eGFP-EGFR mobilitása.Anyag és módszertanAz ADAM17 kódoló régióját Touchdown-PCR-rel amplifikáltuk, majd Gibson assembly-vel illesztettük egy mScarlet3-at hordozó vektorba. A konstruktokat E. coli törzsekben szaporítottuk és glycerol stock-ban tároltuk. Az eGFP-preEGF-et retrovirális transzdukcióval juttattuk a BFP-Giantin markert expresszáló CHO sejtvonalba. Az ADAM-17 expresszióját tranziens transzfekcióval értük el, az EGFR mobilitását és a ligandum–receptor kölcsönhatásokat pedig FCS technikával követtük élő sejtekben.EredményekAz FCS mérések során az eGFP-sEGF diffúzióját vizsgáltuk az EGFR-t nem kifejező, illetve azt kifejező sejtekben. Az EGFR jelenlétében az sEGF diffúziója lelassult és a lassú komponens aránya is megnőtt, ami ligandum–receptor kötődésre utalhat. Előzetes méréseink alapján azokban a mintákban, melyekben mScarlet-ADAM17 és eGFP-preEGF együttesen volt jelen, a prekurzor mobilitása nagyobb volt, mint önmagában.DiszkusszióEredményeink arra utalnak, hogy az eGFP-sEGF intracellulárisan is kötődhet receptorához, ami az intrakrin jelátvitel lehetőségét mutatja. A BFP-Giantin marker alapján a kölcsönhatás a cisz-mediális Golgiban is kimutatható volt. Azokban a mintákban, ahol mScarlet-ADAM17 és a prekurzor együttesen volt jelen, a megnövekedett mobilitás a prekurzor intracelluláris hasítására utalhat. További vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, hogy ez a mechanizmus fiziológiás körülmények között is működik-e.

Témavezető: Dr. Vámosi György és Bilakovics Noémi

Bevezetés: Az IL-15 egy citokin, amelyet főként dendritikus sejtek, makrofágok és monociták termelnek. Receptora az IL-15Rα-ból, valamint az IL-2-vel közös IL-2/15Rβ- és γ c -láncból áll. Az IL-15Rα az antigénprezentáló sejteken (APC), míg a β- és γc-láncok T- és NK-sejteken találhatók, lehetővé téve az IL-15 transzprezentációját. Az IL-15 kulcsszerepet játszik az NK-, T- és B-sejtek differenciálódásában, valamint az NK- és memória T-sejtek fenntartásában. A minden magvas sejt által kifejezett MHC-I molekulák intracelluláris antigéneket prezentálnak a CD8+ T-sejtek, míg az APC-k felszínén található MHC-II molekulák extracelluláris antigéneket mutatnak be a CD4+ T-sejtek antigénfelismerő T-sejt receptorainak (TCR). A mikrovillusok (ujj-szerű kitüremkedések a limfociták felszínén) az első sejt-sejt kontaktusok helyei, ahol az antigénprezentáció (AP) során a TCR és MHC molekulák feldúsulását figyelték meg. Felvetődik a kérdés, hogy az IL-15Rα együttáll-e a mikrovillusokon az MHC fehérjékkel. Célkitűzés: Kutatásunk célja az IL-15Rα és az MHC-I, illetve MHC-II molekulák közötti molekuláris kölcsönhatások vizsgálata a mikrovillusokon. Anyag és módszertan: A molekuláris kölcsönhatásokat modern mikroszkópiás eljárásokkal, kolokalizációs analízissel és FRET mérésekkel vizsgáltuk. A STED olyan szuperrezolúciós eljárás, amely során a gerjesztő lézer mellett egy fánk alakú depléciós lézert is alkalmaznak, amely összezsugorítja a gerjesztett térfogatot. A FLIM-FRET mérés azon alapszik, hogy két 2-10 nm közelségben elhelyezkedő fluoreszcens molekula közt sugárzásmentes energiaátadás jöhet létre. Ebben az esetben a donor molekula fluoreszcencia élettartama lecsökken. Eredmények: A STED kolokalizáció mérések során azt figyeltük meg, hogy az IL-15Rα – MHC-I és az IL-15Rα – MHC-II párok esetén is szignifikánsan magasabb volt a korrelációs együttható a negatív kontrollhoz (transzferrin receptor – MHC-I) képest. A FLIM-FRET mérések igazolták az IL-15Rα – MHC-I illetve a pozitív kontrollnál is magasabb FRET hatásfokot adó IL-15Rα – MHC-II fehérjepárok molekuláris közelségét a mikrovillusokon. Diszkusszió: Az eredmények arra engednek következtetni, hogy az IL15Rα, az MHC-I és az MHC-II molekuláris közelségben, közös membrán doménekben találhatók meg a B-sejtek mikrovillusain, ezáltal megfelelő AP-t és kostimulációt biztosítva.

Témavezető: Dr. Vámosi György

Az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) jelátviteli útvonalainak kiemelt szerepe van a sejtek proliferációjában. A tirozinkináz aktivitású receptort az EGF aktiválja, melynek során az extracelluláris régió dinamikus konformációváltozáson megy át. Az EGFR rendezett egységei mellett rendezetlen régiókat is tartalmaz, melyek natív állapotukban nem definiálhatóak egyértelmű térszerkezettel, mégis a nagyfokú flexibilitásuknak köszönhetően fontos biológiai funkciókkal bírnak. Az intracelluláris rendezetlen domének autofoszforilációban betöltött szerepe mára jól tanulmányozott, ezzel szemben az extracelluláris rendezetlen domének jelentősége még nem tisztázott.Célunk volt megvizsgálni, hogy az extracelluláris dimerizációs kar rendezetlen régiói miként befolyásolják az EGFR dinamikáját, az aktív receptorkomplex összeszerelődését és tirozinfoszforilációját. Mindezt a fehérje dimerizációs karjában létrehozott célzott pontmutációkon keresztül közelítettük meg. A mutációs helyeket és várt hatásaikat kollaborációs partnerünk a FuzPred szoftver segítségével határozta meg. Munkánk során a receptor dimerizációját N&B, FRET és FRAP módszerekkel vizsgáltuk, és immunfluoreszcensen követtük az EGF indukált tirozinfoszforilációs választ. A mutációk klaszterizációra kifejtett hatását szuperrezolúciós mikroszkóp segítségével figyeltük meg. Kísérleteinket vad típusú és mutáns EGFR-rel transzfektált CHO sejteken végeztük el, EGF stimuláció mellett és nélkül. Kapott eredményeink alátámasztották a predikciókat. A T274G mutáció estében a predikció szerint a proteindinamika fokozódik, gyengítve az interakciókat a receptor alegységek között. Adataink alapján azonban ez a hatás elhanyagolhatónak bizonyult a dimerek kialakulásában, de csökkentette az EGF indukált tirozinfoszforilációt. A Q276F és K284Q mutációk esetében a proteindinamika csökkenését vártuk, azonban ez a Q276F mutáció esetében elősegítette, míg a K284Q mutációnál mérsékelte a dimerizációt. Az EGF által kiváltott tirozinfoszforilációs válasz a dimerizációval párhuzamosan változott ezen két mutáció esetében. A csökkent dinamika dimerizációra kifejtett eltérő hatása valószínűleg annak tudható be, hogy a vad típusnál kisebb dinamika elősegíti a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat, de a dimerizációs kar túlzott merevsége gátolja azt.Eredményeink alapján az EGFR extracelluláris rendezetlen régiói jelentősen befolyásolják a proteindinamikát, az aktív receptor komplex képződését, és ezáltal a tirozinfoszforilációt.

Témavezető: Dr. Csomós István és Prof. Dr. Nagy Péter

Cariprazine (CP) is a novel antipsychotic drug used in the treatment of schizophrenia and manic or mixed episodes of bipolar disorder. It acts primarily as a D3 and D2 dopamine receptor partial agonist, with a preference for the D3 receptor.Certain members of the ABC transporter family including ABCB1, ABCG2 and ABCC1 are multidrug transporters that can export numerous lipophilic or amphiphilic drugs out of cells on the expense of ATP hydrolysis. Since the above-mentioned ABC transporters are present in pharmacologically relevant barrier tissues such as intestinal epithelium, blood-brain barrier, liver and kidneys, they are important determinants of the pharmacokinetics of their substrates. Inhibition or reduced expression of the transporters in response to other co-administered drugs may cause altered pharmacokinetics and unwanted side effects of chemotherapy. A recent study demonstrated that CP inhibits the transport activity of a mutant ABCG2 variant possessing altered substrate specificity compared to wild-type (Wt) ABCG2. Here we aimed to explore the interaction of CP with Wt ABC transporters including ABCG2 and ABCB1. We studied the effects of CP on the ATPase activity and on the transport activity of the transporters. In ATPase assays, we used membrane samples isolated from cells overexpressing one of the studied transporters. In transport assays, we used the same cell lines and studied the cellular accumulation of specific fluorescent substrates, such as calcein-AM for ABCB1 and mitoxantrone (MX) for ABCG2. We observed that CP reduced the ATPase activity of Wt ABCG2 and increased the cellular accumulation of MX in a concentration dependent manner supporting that it can act as an inhibitor of the Wt ABCG2. On the other hand, CP increased the ATPase activity of Wt ABCB1, while also elevating the intracellular accumulation of calcein-AM, suggesting that CP is a substrate of ABCB1 that can compete with calcein-AM for binding to the transporter. Taken together, CP is a dual ABC transporter ligand that may be involved in versatile drug-drug interactions, when CP treatment is co-administered with other ABC transporter substrate or inhibitor drugs including certain anti-cancer drugs, digoxin or verapamil among others.

Témavezető: Dr. Goda Katalin