Bevezetés: A trombin aktivitásának reverzíbilis gátlása endogénen elsősorban az alfa-2-makroglobulin (A2M), míg exogénen a gyógyszerként alkalmazott közvetlen trombin gátlószer (dabigatran) által valósul meg. Az A2M jelentősen változik számos betegségben, melyek koagulopátiákhoz vezethetnek. A dabigatran hatékonyságának mérése a személyre szabott dozírozás mellett bizonyos speciális klinikai helyzetekben (pl. sürgősségi műtét, súlyos vérzés) elengedhetetlen.Célkitűzés: Célunk egy trombin-specifikus, kromogén szubsztrát alapú aktivitásmérés kidolgozása volt, amely alkalmas a trombin gátlás mértékének becslésére szérumban. Módszerek: A méréseket kinetikus módszerrel végeztük a trombinra specifikus S-2238 szubsztráttal COBAS INTEGRA 400 plus klinikai automatán. Az endogén trombin gátlás mértékének meghatározásához antikoaguláns kezelésben nem részesülő egyének (n=45) szérummintáit használtuk fel. Az exogén gátlás mértékének becslésére a humán szérumot trombin gátlószerekkel egészítettük ki. Az IC50-értékek meghatározása nem-lineáris regressziós analízissel történt. Eredmények: A 45 kontroll minta alapján a módszerre jellemző trombin aktivitás mediánértéke 1,307 AU (IQR 0,792–2,773). A trombin endogén gátlásának mediánértéke 29,48% (IQR 25,24–34,00). Az exogén gátlószerrel meghatározott IC50-értékek: dabigatran esetén 163 nM (n = 3; SD 47), míg argatroban esetén 302 nM (n = 1). A dabigatran gyógyszer szabad plazmakoncentráció tartományát figyelembe véve a várható gátlási érték emelkedése (az endogén gátláson felül) 5,0% (SD 2,0) – 34,2% (SD 3,5) közé esik.Konklúzió: A beállított módszer alkalmas a trombinra ható endogén, reverzíbilis gátlószerek és közvetlen trombin gátló gyógyszerek hatékonyságának mérésére. Ezzel a trombin regulációhoz köthető koagulopátiák felismerésére és a trombin gátlóval kezelt betegek személyre szabott gyógyítása lehetővé válhat.

Témavezető: Prof. Dr. Tóth Attila

A transzglutamináz enzimcsalád tagjai kalcium-függő aciltranszferázok amelyek fehérjék poszttranszlációs módosításait végzik izopeptid kötések kialakításával. Az enzimcsalád tagjai különböző szövetekben fordulnak elő és változatos fiziológiás és patológiás folyamatokban játszanak szerepet. A transzglutamináz 6 (TG6) elsősorban a központi idegrendszerben kifejeződő fehérje, amely hozzájárulhat az idegrendszer fejlődéséhez és a motoros funkciók szabályozásához. A fehérjét autoantigénként azonosították glutén ataxiában, valamint genetikai mutációi hozzájárulnak a spinocerebellaris ataxia 35 kialakulásához, de ezen kórképekben játszott szerepe pontosan nem ismert. Kutatócsoportunk írta le, hogy a szöveti transzglutamináz (TG2) rendelkezik egy újonnan felismert RNS-kötő képességgel. A transzglutamináz enzimcsaládban ez a képesség összefüggést mutat az enzim GTP-kötő sajátságával és a TG6 rendelkezik a legmagasabb RNS-kötő affinitással.Célul tűztük ki a TG6 RNS-kötésének jellemzését és kötési sajátosságainak összehasonlítását a már részletesebben vizsgált TG2 ilyen tulajdonságaival.Mágneses RNS-fehérje pulldown kísérletek azt mutatták, hogy a TG2-vel ellentétben a GTP-t kötött zárt és Ca2+-ot kötő nyílt TG6 konformációkat stabilizáló inhibitorok (GTPγS, Z-DON) jelenlétben is kötődik a korábban is használt 43-mer RNS molekulához. A konformáció-függés vizsgálatára natív poliakrilamid gélelektroforézist alkalmaztunk, de a TG2-vel szemben a TG6 csak kis mértékben vándorolt be a gélbe és nem lehetett szeparálni a zárt és nyílt formákat. Meglepetésként SYBR Gold festéssel mindkét preparátumban detektáltunk nukleinsavra utaló jelet, főleg a gél tetején maradt fehérjékkel együtt, ami azt sugallja, hogy a preparátumok transzglutamináz kötött nukleinsavat tartalmaznak. Ezt agaróz gélben végzett vizsgálatok Proteináz K és nukleáz kezelésekkel is megerősítették. A TG6 esetén a gélekben is kimutattuk a 43-mer RNS kötését, ami nem befolyásolta a TG6 transzamidáz aktivitását.A TG6 RNS-kötő képességének szerkezeti magyarázatára, fehérje-RNS dokkolási vizsgálatokat végzünk, hogy meghatározhassuk, mely aminosavak vagy szerkezeti elemek vehetnek részt a kölcsönhatásban. A TG6 RNS-kötésének vizsgálata hozzájárulhat a fehérje neuronális funkciókban játszott szerepének, és így a TG6 által befolyásolt neurodegeneratív kórképek patobiokémiájának megértéséhez.A kutatás az EKÖP-25-2-DE-74 támogatásával készült.

Témavezető: Dr. Király Róbert és Rahim Alaa Ahmed

Az emberi szervezetben számos olyan, ún. retrotranszpozon Gag-szerű multidomén fehérje expresszálódik, melyek nagyfokú szerkezeti és funkcionális hasonlóságot mutatnak bizonyos retrotranszpozon és retrovírus (pl. HIV) fehérjékkel. Néhány ilyen fehérje a retrovírusok aszpartil proteázával homológ enzimatikus domént is tartalmaz, azonban a legtöbb ilyen fehérje esetében még nem vizsgálták, hogy a proteáz domén rendelkezik-e aktivitással. Ilyen többek között az NRIP2 és NRIP3 fehérje is (nuclear receptor interacting protein 2 és 3), melyek génexpressziós szabályozó folyamatokban részt vevő magreceptor-kötő fehérjék, azonban nem ismert, hogy proteáz aktivitásuknak van-e szerepe a működésükben.Kutatásaink célja az NRIP2 és NRIP3 fehérjék működésének vizsgálata volt, különös tekintettel a proteáz aktivitás kimutatására. Célul tűztük ki a vad típusú valamint az irányított mutagenezissel módosított fehérje-formák előállítását és tanulmányozását sejtkultúrás rendszerben.Vizsgálatainkhoz irányított mutagenezissel módosítottuk az NRIP2 és NRIP3 fehérjéket kódoló expressziós plazmidokat, majd a tisztított vektorokat humán embrionális vesesejtek (HEK293T) transzfekciójára használtuk fel. A fehérjéket zöld fluoreszcens fehérjével (GFP) vagy hexahisztidin címkével fúzionált formában expresszáltattuk, majd fluoreszcencia alapján mikroszkópiával vagy fehérje-specifikus antitestekkel, Western-blot technikával mutattuk ki. Vizsgálataink során tanulmányoztuk a fehérjék proteolitikus aktivitását, valamint sejten belüli és sejten kívüli lokalizációjukat, továbbá megkezdtük feltételezett hasítási pozíciók és kölcsönható partnerek vizsgálatát is. Eredményeink a vad típusú és a funkció szempontjából jelentős régiókban (így a proteáz domén aktív helyén és/vagy a sejtmagi lokalizációért feltételezhetően felelős régióban) módosított fehérjeformák közti különbségeket tártak fel, igazolva ezzel a módosított régiók funkcionális jelentőségét. Eredményeink betekintést nyújtanak az NRIP2 és NRIP3 működésébe és elsőként adnak információt eddig még nem vizsgált proteolitikus aktivitásukról. A projekt a TKP2021-EGA-20 program, az MTA Bolyai János Kutatási Ösztöndíj (BO/00110/23/5, M.J.A.) és a Debreceni Egyetem DETEP (L.B.) programjának segítségével valósult meg.

Témavezető: Dr. Mótyán János András

Thermogenic activation of adipocytes demands high amounts of nutrients including iron which is essential for rapid mitochondrial biogenesis. Global transcriptomic analysis showed that the expression of genes encoding iron transport-related proteins was upregulated in response to adrenergic-driven thermogenic stimulation modelled by the cell permeable dibutyryl (db)-cAMP. Therefore, we investigated if restriction of iron availability by chelation prevents the effective thermogenic response.Subcutaneous (SubQ) and deep cervical (DeepC) adipose tissue biopsies were obtained and then the stromal vascular fraction (SVF) was isolated. Preadipocytes cultivated from SVFs were differentiated to adipocytes for 14 days. Mature adipocytes were treated with db-cAMP, or deferoxamine (DFO), or combination of db-cAMP and DFO. Intracellular iron level was measured by a commercially available colorimetric assay. The expression of mitochondrial and thermogenic genes and proteins was investigated by RT-qPCR and immunoblotting, respectively. Oxygen consumption rate was assessed by Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer. Proton leak respiration that associates with UCP1-dependent heat production was detected after the injection of the ATP synthase inhibitor, oligomycin.We found that the intracellular iron contents were increased by db-cAMP in both SubQ and DeepC-derived adipocytes, which exerted moderate or high thermogenic competency, respectively, and this elevation was impaired by DFO. The chelator decreased stimulated maximal and proton leak respiration during activation in both adipocyte types. We also found that DFO prevented the upregulation of mitochondrial complex I, II, and IV subunits only in DeepC-derived activated adipocytes, except for the complex I subunit. The db-cAMP-stimulated elevation of UCP1 and PGC1a expression was hampered by DFO at both mRNA and protein levels only in DeepC-derived adipocytes. Iron depletion decreased the protein expression of PGC1a in DeepC-derived adipocytes at unstimulated condition, likely due to impaired mitochondrial biogenesis which requires high amounts of iron. In addition, we also investigated the expression of DIO2, CITED1, and PM20D1 and found that their adrenergic-driven upregulation was prevented in the presence of DFO. These data suggest that iron is required for the thermogenic response of adipocytes not only as a critical component of mitochondrial complexes but also as an effector of gene transcription regulation.

Témavezető: Dr. Kristóf Endre és Dr. Arianti Rini

Trypsinogen, secreted into the bicarbonate-rich pancreatic juice, is physiologically activated to trypsin by enteropeptidase in the gut. Premature trypsinogen auto-activation within the pancreas contributes to pancreatic proteolysis and pancreatitis. Chymotrypsin C (CTRC) reduces this risk by degrading trypsinogen. Although acidic conditions have been shown to enhance trypsinogen auto-activation, their impact on CTRC function remains unclear. Our aim was to examine how reduced pH influences trypsinogen auto-activation with and without CTRC.Human cationic trypsinogen (Tg-Hu1) and CTRC were recombinantly expressed and purified with affinity chromatography. Enzyme concentrations were determined by either OD measurements at 280 nm or active site titration. Tg-Hu1 and CTRC were activated with cationic trypsin (Tr-Hu1). Activities of Tr-Hu1 and CTRC were measured at pH 5.0, 6.0, 7.0 and 8.0 in Tris-HEPES-MES, Tris-HEPES or Tris-MES buffers using chromogenic peptide substrates. Tg-Hu1 degradation by CTRC was assessed by protein gel electrophoresis under denaturing and reducing conditions.Both Tr-Hu1 and CTRC showed maximal catalytic activities in Tris-HEPES-MES buffer at pH 8.0, and progressively lower activities at pH 7.0, 6.0 and 5.0. Interestingly, Tg-Hu1 auto-activation in the absence of CTRC was slightly higher at pH 7.0 and 6.0 than at pH 8.0. CTRC reduced Tg-Hu1 auto-activation in Tris buffer at pH 8.0. However, when auto-activation was performed in the presence of CTRC in Tris-HEPES-MES buffer, an unexpected increase in activation rate was observed, particularly at pH 8.0. Protein gel electrophoresis experiment confirmed reduced Tg-Hu1 degradation by CTRC under these conditions. Consistent with this finding, CTRC exhibited lower catalytic activity on a chromogenic substrate at pH 8.0 in both Tris-HEPES and Tris-MES buffers compared to Tris buffer alone. As a result, Tg-Hu1 auto-activation proceeded even quicker in the presence of CTRC when HEPES or MES was included in the buffer. Our results demonstrate that buffer components can inhibit proteolytic enzymes and thereby influence enzyme-substrate interactions. Thus, careful buffer selection is essential for reliable protease activation measurements.

Témavezető: Dr. András Szabó

Differentiation syndrome (DS) is a rapidly developing, lethal side effect of all-trans-retinoic acid (ATRA) or arsenic trioxide (ATO) treatment in patients with acute promyelocytic leukemia (APL). DS is associated with an extensive release of inflammatory cytokines/chemokines. As a result of ATRA treatment, cells undergo terminal differentiation, and the expression of several genes, such as tissue transglutaminase (TGM2) becomes upregulated. TG2 plays a role in cell proliferation and apoptosis and participates in the development of tumors. In the case of atypically TG2-expressed APL cells are associated with an inflammatory "cytokine storm" response. Currently, no high-efficacy inhibitors are used in clinics.In chronic inflammation or cancer, unregulated NF-κB activity is associated with high TG2 expression. We hypothesize that the magnitude of TG2 expression enhances inflammatory processes. We are currently investigating whether 25(OH)D3 has a significant anti-inflammatory effect when administered alone, with ATRA, or in combination with both ATRA and ATO. NB4 cell lines (APL) containing the NF-κB promoter-driven luciferase reporter gene would be used. We investigate whether administration of 25(OH)D3 together with ATO will influence the pathway activity. RT-qPCR measurement will be performed to investigate how inflammatory cytokines/chemokines mRNA expression is affected; finally, the expression pattern of the pathway’s crucial proteins will be analyzed by Western blot. Using qPCR, we also measured the mRNA expression of REDOX genes (GPPHOX91, PRDX5, GST01, NRF2, NCF2). The superoxide measurement was conducted using a semi-quantitative method that involved DCFDA and L012 dye-based fluorimetric analysis. Co-administration of 25(OH)D3 and ATO appeared to modulate NF-κB pathway activity and attenuated the mRNA expression of several cytokines and chemokines.The NF-kB pathway is the major pathway which conducts immune cell survival and pro-inflammatory effects to keep our body safe. 25(OH)D3 administration together with ATRA and ATO could help us achieve an anti-inflammatory response which affects the main trunk of the NF-kB pathway via the inhibition of transcriptional activity, which in turn shuts down the production of chemokines and cytokines, hence curbing the unwanted effects of inflammation. We also detected that the different treatment administrations attenuated the superoxide production of differentiated NB4 cells.

Témavezető: Dr. Balajthy Zoltán és Dr. Jambrovics Károly

Huntington’s disease (HD) is an autosomal dominant neurodegenerative disorder caused by a mutation—a CAG trinucleotide expansion repeat—in the first exon of the huntingtin gene (HTT). HD affects both the central nervous system (CNS) and non-neuronal tissues because the HTT gene is expressed ubiquitously. While the molecular mechanisms and effects on the CNS have been well studied, the impacts on peripheral tissues are still not fully understood.PA200 is an alternative proteasome activator found in all mammals. It mediates ATP- and ubiquitin-independent degradation of unstructured proteins and acetylated histones. PA200 is present in all mammalian tissues and is highly expressed in testes. It is well established that PA200 is necessary for normal spermatogenesis in mice, indicating that the proper production of male gametes requires specific protein metabolic processes. Homozygous PA200 knockout mice are infertile. According to the literature, the initial reproductive capacity is usually not directly affected in HD patients; it is mainly the huge dilemma that arises after testing positive for HD.Our HD transgenic mouse model, however, shows reduced testis size, reduced fertility rate, and significantly decreased PA200 expression in the testes. Hence, we aim to explore the molecular link between reduced fertility and PA200-proteasome activity in HD male mice.Testes from 24-week-old hemizygous HD Exon1 R6/1 transgenic and wild-type (WT) mice were dissected and processed for hematoxylin and eosin staining (H&E), total RNA extraction, and tissue lysis for SDS-PAGE and western blotting.Our preliminary results indicate that large euchromatic primary spermatocytes are no longer present, and there are few spermatids or spermatozoa in HD testes. The interstitium and Leydig cells are indeed smaller and fewer in number compared to WT. The interior of the seminiferous tubule is completely disorganized. The lateral connections of the Sertoli cells do not separate the layer of spermatogonia. RNA-seq confirms that genes involved in spermatogenesis, chromatin remodeling, proteolysis, and stress response are significantly downregulated in HD male mice. Validation of RNA-seq data by qPCR is ongoing.Furthermore, western blot analysis showed reduced expression of the catalytic subunit PSMA8 of the spermatoproteosome. In summary, we suggest that mechanisms of spermatoproteasome-dependent protein degradation are disrupted, leading to reduced fertility in HD male mice.

Témavezető: Dr. Tar Krisztina és Ali HossamEldin

Proteomics is the field that analyzes proteins and their interactions, functions, compositions, and structures. It shows significant promise across diverse sectors, especially within the realm of medicine. Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most prevalent malignancy of the oral cavity and the 6th most common malignancy worldwide. In recent years, saliva has been recognized as a valuable diagnostic tool for evaluating oral health, as it can be collected non-invasively and reliably reflects pathological states through its direct interaction with potentially pathological secretions. Among its many essential functions of saliva, it plays a crucial role in innate immunity due to its richness in antimicrobial and immunomodulatory peptides/proteins (AMPs), including defensins, cathelicidins, histatins and lysozyme.This ongoing study employs proteomic-based techniques to analyze salivary proteins, aiming to identify potential biomarkers for OSCC by comparing the profile of protein abundances[u1] between affected individuals and healthy controls. Moreover, our work aims the identification of AMPs to discover their alterations in OSCC, providing a comprehensive picture of changes in immune processes.Samples were collected from 3 different clinics across Hungary (Debrecen, Budapest, and Szeged). Altogether, 10 controls and 10 patients with OSCC were selected and matched by their age and sex. The samples were centrifuged and their supernatant was used for further analyses. The protein concentration in each sample was determined and digestion was performed using an in-house developed in-solution digestion method; then the samples were desalted before liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analyses. The LC-MS data were collected in data-independent acquisition (DIA) mode and after data analysis, the proteome profiles of the studied groups were compared focusing on the AMPs.The significance of this research lies in the early detection of OSCC from saliva, particularly because this disease remains asymptomatic throughout its course until its advanced stage. Moreover, the examination of AMPs may reveal the immune-related changes underlying oral cancer, thereby helping to shape our understanding of the molecular and immunological processes behind OSCC.This project was supported by the János Bolyai Research Scholarship of the Hungarian Academy of Sciences.

Témavezető: Dr. Kalló Gergő és Bertalan Petra Magdolna