OETDK.

Brown/beige adipocytes express uncoupling protein-1 (UCP1) in their inner mitochondrial membrane. It facilitates the dissipation of energy as heat in response to cAMP-driven signalling initiated by cold exposure. This adrenergic-driven activation pathway is a potential therapeutic target for treating type 2 diabetes mellitus, obesity, and related co-morbidities. Therefore, identifying novel approaches to stimulate thermogenic adipocytes is crucial for advancing therapeutic strategies. The Simpson-Golabi-Behmel syndrome (SGBS) preadipocyte cell line has been proven as a valuable model to investigate human adipocyte biology. In this study, we investigated how excess thiamine (vitamin B1), which is a critical cofactor of mitochondrial enzyme complexes, affects the expression of thermogenic markers and functional parameters during the activation of SGBS adipocytes. We differentiated SGBS preadipocytes into energy storing ADIP or heat producing B-ADIP (by long-term rosiglitazone) for 14 days, then treated them separately with excess thiamine or dibutyryl (db)-cAMP, as well as in combinations of the two compounds for 10 hours. The mRNA and protein expression of thermogenic genes was evaluated by RT-qPCR and western blot, respectively. Functional study to measure oxygen consumption and extracellular acidification rates was performed by Seahorse XF Pro Metabolic Analyzer. We found that excess thiamine enhanced the db-cAMP-dependent induction of thiamine transporter 1 and 2 along with the upregulation of UCP1, PGC1a, and other browning markers such as CIDEA, DIO2, CITED1, TBX1, and CKMT2 in both ADIP types. The expression and secretion of the batokine, interleukin-6, were also elevated only in ADIP but not in B-ADIP. In addition, abundant amounts of thiamine enhanced the basal, unstimulated coupled and uncoupled respiration, and the expression of mitochondrial complex subunits in both ADIP types. Finally, we retrieved data from adiposetissue.org and found that the mRNA and protein expression of both thiamine transporters in white adipose tissue inversely correlated with body mass index, waist-hip-ratio, insulin resistance, circulating cholesterol, low-density lipoprotein, and glucose, adipocyte volume, and leptin secretion which are anthropometric and clinical parameters indicating obesity and its co-morbidities. Our study highlights the critical role of excess thiamine in the thermogenic activation of SGBS adipocytes and its potential to improve metabolic health.

Témavezető: Dr. Kristóf Endre Károly és Dr. Arianti Rini

Bevezetés A sejtmembrán három elektromos tulajdonsága a transzmembrán-, a felületi- és a dipólpotenciál, amelyek együttesen alakítják ki a membránpotenciált. A dipólpotenciál a membránalkotók rendezett dipólmomentumaiból származik, és korábbi vizsgálatok szerint hatást gyakorol az ErbB receptorok jelátvitelére, valamint a transzmembrán potenciál befolyásolja az IL-2 receptor jelátviteli hatékonyságát.CélkitűzésVizsgálatunk középpontjában az állt, hogy feltárjuk a dipólpotenciál, ezen kevéssé vizsgált biofizikai paraméter hatását az interleukin-2 (IL-2) receptor jelátviteli hatékonyságára gyakorolt .Anyag és módszertan A dipólpotenciál 6-ketocholestanol és phloretin kezeléssel módosítottuk. A sejtek életképességét fluoreszcein-diacetát és propídium-jodid jelöléssel vizsgáltuk áramlási citometria segítségével (100-200-300 μM; 30 perc). A dipólpotenciál változását feszültségérzékeny fluoreszcens festékekkel ellenőriztük konfokális mikroszkópia segítségével. Továbbá áramlási citométer segítségével az IL-2 receptor jelátviteli hatékonyságát mértük aktiválást követően a foszforilált STAT5 mennyisége alapján.Eredmények A sejtek életképessége 100 és 200 μM koncentráción (30 perc) sem csökken 90% alá az általunk alkalmazott Kit225/K6 T-sejtvonal esetében. A dipólpotenciál változásának mérése alapján a 6-ketokolesztanol kezelés esetén minden vizsgált koncentrációban statisztikailag szignifikáns eltérést tapasztaltunk (p < 0.0001); míg a phloretin kezelés esetén a magasabb koncentrációban (200 μM; 30 perc) figyeltünk meg statisztikailag szignifikáns eltérést, ezért a következő vizsgálatokat ebben a koncentrációban végeztük el. A jelátviteli hatékonyság vizsgálata során a 6-ketokolesztanol kezelés hatására a STAT5 foszforiláció minden időpontban statisztikailag szignifikánsan csökkent (p < 0.001) az oldószer-kontrollhoz (pluronic+etanol) képest, míg a phloretin kezelés esetében a STAT5 foszforiláció nem változott. Ezek alapján levontuk azt a következtetést, hogy a dipólpotenciál értékének emelkedése esetén az IL-2 receptor jelátviteli hatékonysága lecsökken. Diszkusszió A kapott eredmények összhangban állnak a korábbi irodalmi adatokkal, miszerint a sejtmembrán elektromos tulajdonságainak módosulása befolyásolja a membránfehérjék működését. A projekt során sikerült igazolni, hogy a dipólpotenciál értékének módosulása jelentősen befolyásolja az IL-2 receptor jelátviteli hatékonyságát. Ezen változás hátterének feltárása további vizsgálatokat igényel.

Témavezető: Dr. Vámosi György

A tüdő adenokarcinóma világszerte vezető szerepet tölt be a daganatos megbetegedésekhez köthető halálozások között, azonban patomechanizmusa máig nem tisztázott. A Mn2+/Mg2+-függő protein foszfatáz 1B (PPM1B) egy kevésbé tanulmányozott, fémion-függő protein foszfatáz, amely részt vesz az apoptózis, az immunmoduláció és a stresszválasz szabályozásában. Korábbi in vitro vizsgálatok alapján a miozin foszfatáz (MP) MYPT1 szabályozó alegységének gátló foszforilációs Thr696 helyét a PPM1B defoszforilálja, ezáltal növelve a MP aktivitását. Ismert, hogy a protein arginin metiltranszferáz 5 (PRMT5) a MP szubsztrátja, és a hiszton 2A (H2A) szimmetrikus dimetilációjával a tumorszuppresszorok génexpresszióját szabályozza. Ezen előeredmények alapján vizsgálatunk célja volt a PPM1B overexpresszió hatásának vizsgálata az MP/PRMT5/H2A tumorszuppresszor jelátviteli útvonal szabályozására humán tüdő adenokarcinóma sejtvonalban. Immunfluoreszcens intenzitás analízissel kimutattuk, hogy a PPM1B overexpresszió a MYPT1 alegység Thr696 foszforilációjának csökkenését eredményezte, miközben előidézte a MYPT1 alegység foszforilált formájának transzlokalizációját a sejtmagból a perinukleáris és citoplazmatikus régiókba. Ezt kísérte a PRMT5 Thr80 aktiváló foszforilációjának csökkenése, ami a PRMT5 gátlását eredményezte. Ez a H2A génexpressziót gátló szimmetrikus dimetilációjának csökkenését eredményezte. A génexpresszió változás hatását Humán Foszfokináz vizsgálattal elemeztük. A PPM1B overexpresszió fokozta a p53 tumorszuppresszor fehérje aktiváló foszforilációját (Ser15, Ser46 és Ser392 oldalláncokon), miközben csökkentette számos protoonkogén – köztük a GSK3, RSK1/2/3, HSP27 és p70S6 kináz – aktivitását azok aktiváló foszforilációjának csökkentésével. Funkcionális vizsgálataink során a tüdő adenokarcinóma sejtek inváziós és kolóniaképző képessége szignifikánsan csökkent a PPM1B overexpresszió hatására. Eredményeink alapján a PPM1B kulcsfontosságú szabályozó szerepet tölt be a MP/PRMT5/H2A tumorszuppresszor tengelyen szabályozó elemeként, így potenciális biomarker és terápiás célpont lehet a tüdő adenocarcinoma kezelésében.

Témavezető: Dr. Lontay Beáta és Dr. Keller Ilka

Az adipociták három fő típusát különböztetjük meg: fehér, barna és beige.A fehér adipociták elsősorban a trigliceridek tárolására specializálódtak, ezáltal a szervezet fő energiaraktárát képezik. Ezzel szemben a barna adipociták mitokondriumban gazdagok és a hőtermelésért felelősek az uncoupling protein 1 (UCP1) aktivitása révén. A szintén termogenikus beige adipociták a fehér zsírszövetben találhatók, és külső ingerek – például hideg hatás vagy fizikai aktivitás – hatására jelenhetnek meg; ezt a folyamatot „barnulásnak” nevezik. Bizonyos étrendi tényezők szintén elősegíthetik az adipociták barnulását, mely csökkentheti az elhízás kockázatát.Előzetes adataink azt mutatták, hogy a mio-inozitol transzporter (az SLC2A13 gén által kódolt fehérje) expressziója fokozódott adrenerg stimuláció hatására humán nyaki eredetű adipocitákban. Korábban azt találtuk, hogy a mio-inozitol cukor-alkohol barnulást indukált humán nyaki szubkután eredetű adipocitákban. Jelen tanulmányban a Simpson–Golabi–Behmel szindrómában (SGBS) szenvedő gyermekből származó adipocitákat – egy bevált humán preadipocita modellt, amely jól utánozza a primer szubkután adipociták viselkedését – alkalmaztuk annak vizsgálatára, hogy a mio-inozitol kezelés az adipogenezis során miként befolyásolja a barnulást.Az SGBS preadipocitákat 14 nap alatt differenciáltattuk fehér (ADIP) vagy beige adipocitává (B-ADIP) hosszú távú roziglitazon-kezeléssel, mio-inozitol kiegészítés nélkül vagy 140 µM végkoncentrációjú mio-inozitol jelenlétében. A termogén gének mRNS- és fehérje-szintű expresszióját RT-qPCR-rel, illetve western blottal értékeltük. A funkcionális vizsgálatokhoz az oxigénfogyasztási rátát (OCR-t) és az extracelluláris acidifikációs rátát (ECAR-t) Seahorse XF Pro Metabolic Analyzer segítségével mértük.Eredményeink azt mutatták, hogy a hosszú távú mio-inozitol-kezelés növelte az UCP1, PGC1α és PM20D1 expresszióját mind az ADIP, mind a B-ADIP mintákban, továbbá fokozta a mitokondriális I. és IV. komplex alegységek mennyiségét is. Ezzel párhuzamosan az ADIP-ok bazális OCR- és ECAR-értékei szintén emelkedtek a mio-inozitol hatására. Továbbá megfigyeltük, hogy a mio-inozitol kizárólag a B-ADIP mintákban fokozta a glükóz transzporter 3 (GLUT3/SLC2A3) expresszióját.Eredményeink arra utalnak, hogy a mio-inozitol kezelés elősegíti a humán SGBS adipociták barnulását, és így az egy kedvező mellékhatásprofilú, megfizethető terápiás stratégiát kínálhat az elhízás elleni küzdelemben.

Témavezető: Dr. Kristóf Endre és Dr. Arianti Rini

Bevezetés: A Ca2+ fontos másodlagos hírvivő, a szívizomban szükséges akontraktilitáshoz, intracelluláris szintje pontosan szabályozott és számos, az akcióspotenciált (AP) kialakító ionáramot befolyásolhat. Célunk ezért az AP paraméterek Ca2+függésének retrospektív felderítése volt.Módszerek: A humán jó modelljének tekinthető kutya bal kamrai izolált szívizomsejteken apatch-clamp módszer teljes-sejtes elrendezésében felvett AP-kat vizsgáltunk. A Ca2+pufferelése 10 mM Bapta mikropipetta oldatban való alkalmazásával történt, kontrollkéntpedig a fiziológiás viszonyoknak megfelelő pipetta oldatot használtunk. Az AP paramétereket(pl. AP időtartam több repolarizációs százaléknál (APD értékek), nyugalmimembránpotenciál (RMP), AP csúcsérték, AP amplitúdó (APA), az AP 0., 1. és 3. fázisánakmaximális meredeksége (V+max, VPh1max és V-max), illetve korai és késői platopotenciálok) analizáló program számolta ki. A sejtek transzmurális eredetét (epi, mid ésendo) az AP alakja alapján önkényesen döntöttük el.Eredmények: Mid sejtekben (n=144 kontroll és 60 Bapta) az APD 20, 50, 75 és 90%-osrepolarizációnál mért értékei is szignifikánsan nagyobbak voltak Bapta jelenétében (pl.APD50: 224±5 és 329±9 ms, APD90: 288±6 és 386±10 ms (átlag±standard hiba)). A platopotenciálok kisebbek, a V+max és V-max értékei pedig nagyobbak voltak a kontrollcsoportban. Az RMP kisebb, a csúcsérték hasonló és az APA értéke nagyobbnak adódottBapta esetén. Epi sejtekben (n=89 kontroll és 18 Bapta) hasonló különbséget figyeltünk mega két csoport között, de az RMP, APA és a V+max értékei nem különböztek. Endo sejtekben(n=81 kontroll és 19 Bapta) a mid sejteknél leírt különbségekhez képest, a V+max és V-maxnem különbözött a Ca2+ pufferelt és a kontroll sejtekben. Az APD50/90 hányados értékemindhárom sejttípus esetén nagyobb volt Bapta jelenlétében.Megbeszélés: Eredményeink szerint a sejten belüli Ca2+ pufferelése jelentősen megnöveliaz akciós potenciál időtartamát és plató fázisának értékét is, a nyugalmi membránpotenciálmid és endo sejtekben kevésbé negatív, a 3. fázis repolarizáció pedig epi és mid sejtekbengyorsabb volt. Fenti változásokat okozhatja az L-típusú kalciumáram kalciumfüggőinaktivációjának puffer jelenlétében tapasztalható hiánya és az ezáltal nagyobb, elnyújtottabbCa2+ beáramlás. Bár a késői nátriumáram Ca2+ jelenlétében nagyobb, de ez valószínűlegnem tudja teljesen ellensúlyozni a megnövekedett Ca2+ beáramlás depolarizáló hatását.Támogatás: NKFIH-K142764, EKÖP-25-3-II-DE-105

Témavezető: Dr. Szentandrássy Norbert és Dr. Óvári József

Kutatásunk során az interleukin-15 receptor (IL-15R) α alegységének lokalizációját vizsgáltuk transzprezentáció során. Ebben a folyamatban a ligandot az antigénprezentáló sejtek által kifejezett IL-15R α alegysége nagy affinitással megköti és bemutatja a T- vagy NK-sejtek felszínén kifejezett, jelátvitelért felelős β és γ alegységeknek. A receptor alegységek a citokinkötést követően állnak össze funkcionális trimerré aktiválva a Jak-STAT5, Ras-MEK-MAPK, és PI3K-AKT-mTOR jelátviteli kaszkádokat, melyek a sejt túlélését, proliferációját, vagy effektor funkciók betöltését segítik. Modellrendszerünk két humán limfoid sejtvonalból áll: az EGFP-IL-15Rα-val stabilan transzdukált Raji B-sejtekből, valamint Jurkat T-sejtekből, amelyek a γ alegységet endogén módon, míg a β alegységet stabil transzdukció eredményeként fejezik ki. Konfokális mikroszkópos vizsgálatainkhoz egyedi mintafelviteli technikát dolgoztunk ki, amely során a sejteket egy Boyden migrációs kamra 8 ųm-es pórusokkal rendelkező membránjának ellentétes oldalaira ülepítjük, ezáltal az IL-15 transzprezentáció során immunszinapszist kialakító sejtek egymás fölött helyezkednek el, lehetővé téve a receptorok eloszlásának vizsgálatát a szinapszis síkjában. Megfigyeltük, hogy a sejtek a pórusokon keresztül a ~10 µm-es membránvastagságot áthidalva is képesek kapcsolatot létesíteni. A kialakuló immunszinapszisokról konfokális mikroszkóppal optikai szeleteket készítünk, majd 3D rekonstrukciót követően vizsgáljuk az EGFP-vel jelölt α alegységek lokalizációját. Megfigyeltük, hogy az α alegységek a szinapszis közelében dúsulnak, mely lehetővé teszi, hogy az IL-15 jelátvitel irányított, erős és szelektív legyen, fokozva a túlélést, a specifikus aktivációt és az effektor funkciókat. Kutatásunk folytatásához olyan Jurkat T-sejtvonal létrehozásán dolgozunk, mely a receptor β alegységét HaloTag-elt formában fejezi ki. A HaloTag-hez specifikusan kötődő fluoreszcens ligandok segítségével a β alegység is nyomon követhetővé válna. A sejtvonal létrehozásához szükséges retrovirális plazmidok előállításához a Gibson Assembly módszert alkalmaztuk. A Jurkat sejtek virális transzdukcióját követően a létrehozott új sejtvonal lehetőséget ad az IL-15Rβ és α alegységek lokalizációjának szimultán vizsgálatára az immunszinapszis kialakulása során.

Témavezető: Dr. Hegedüs Éva és Dr. Vámosi György

A T-sejtek az adaptív immunválasz fontos résztvevői. A T-sejtek Ca2+-függő KCa3.1 csatornái kiemelkedő szereppel bírnak az aktiváció, migráció és effektoros funkciók szabályozásában. A CAR-T képesek a tumorsejtek felszínén található specifikus antigén felismerésére és eliminálására. Kísérleteink célja az volt, hogy kiderítsük a KCa3.1 csatorna szerepét a CAR-T sejtek általi anti-tumorális válaszban.Retrovirális transzdukció segítségével sGFP konjugált, harmadik generációs, CD19-specifikus CAR-t és mCherry konjugált KCa3.1 ioncsatornát expresszáltattunk Jurkat limfocita sejtvonalban és primer T-sejtekben. Live-or-Dye alapú ölési-assay segítségével a KCa3.1-et expresszáló Jurkat CAR sejtek tumorsejt ölő képességét vizsgáltuk TRAM34, KCa3.1 gátlószer jelenlétében/anélkül. Meghatároztuk a KCa3.1+ és KCa3.1- Jurkat CAR sejtek migrációs paramétereit TRAM34 jelenlétében/hiányában. FURA-2-alapú Ca2+-imaging módszerrel az mCherry-KCa3.1+ Jurkat CAR sejtek TG indukált Ca2+ válaszát vizsgáltuk, továbbá ezen módszer segítségével detektáltuk a TRAM34 gátlószer általi Ca2+-alapjel változásait KCa3.1- /KCa3.1+ Jurkat CAR sejtekben. Calcein-Violet AM ölési assay segítségével meghatároztuk a CAR-T és mCherry-KCa3.1+ Jurkat CAR sejtek ölési idejét.Láthatóvá vált, hogy a mCherry-KCa3.1+ Jurkat CAR sejtek ölési rátája magasabb volt a KCa3.1- sejtekénél és a TRAM34 hozzáadása jelentősen növelte a tumorsejtölő képességet. A KCa3.1-t expresszáló Jurkat CAR sejtekben az átlagsebesség és távolság szignifikánsan magasabb volt, mint a KCa3.1- sejtekben, továbbá a TRAM34-gyel történő gátlás növelte a távolsági és elmozdulási paraméterek értékét. Kimutattuk, hogy a KCa3.1 jelenléte jelentősen növeli a TG által kiváltott Ca2+ választ a CRAC-csatornán keresztül, amelyeket a TRAM34 gátlás csak kis mértékben befolyásolt. A FURA-2-alapú i.c. Ca2+ alapszint mérések során a Ca2+ szint jelentősen emelkedett KCa3.1+ Jurkat CAR sejtekben a KCa3.1- sejtekhez képest, míg a TRAM34 alkalmazása csökkenti az i.c. Ca2+ alapjelet. A Calcein Violet AM ölési assay segítségével sikeresen kimutattuk, hogy a KCa3.1 gátlása jelentősen csökkenti a CAR-T és mCherry-KCa3.1+ Jurkat CAR sejtek ölési idejét.Belátható, hogy a KCa3.1 ioncsatorna esszenciális a CAR-T sejtek effektor funkciójának betöltésében. Úgy véljük, hogy adataink kihangsúlyozzák az ioncsatornák fontosságát a CAR T-sejtek fiziológiájában, és azokat moduláló célpontként kell tekinteni az immunterápiák eredményességének javítása érdekében.

Témavezető: Dr. Jusztus Vivien