OETDK.

A 90 kDa-os hősokkfehérje (Hsp90) központi szerepet játszik a melanóma túlélését és progresszióját meghatározó onkogén fehérjék stabilizálásában. A hsp90 a daganatos sejtek felszínén halmozódik fel, és ektopikus Hsp90 (eHsp90) fehérjeként a tumor malignus fenotípusához is hozzájárulhat. Vizsgálataink célja a eHsp90-gátlás sejtszintű hatásainak feltérképezése, illetve az eHsp90 kölcsönható partnereinek vizsgálata volt korai stádiumú (WM35) és metasztatikus (A2058) melanóma sejtvonalakon, kontrollként primer melanocitákat használva. A sejteket membránpermeábilis HS-10 és fluoroforral jelölt, csak az eHsp90-t felismerő HS-131 inhibitorokkal kezeltük és detektáltunk. Kísérleteinkben igazoltuk az eHsp90 akkumulációját a plazmamembránban membránspecifikus markerekkel történő kolokalizáció kvantitatív mérésével Duo Link Proximity Ligation vizsgálattal. Az Oncogene Protein Profiler XL panel alkalmazásával elemeztük a melanociták és a melanoma sejtvonalak kontroll és HS-10 kezelt mintáinak jelátviteli profilját. Az adatok több Hsp90-függő onkogén fehérje expressziójának szelektív csökkenésére utaltak melanómában, különösen a PI3K-, angiogenezis- és az epitheliális-mezenchimális átmenet útvonalakhoz tartozó molekulák – például az ErbB1, a HIF-1α és a Snail – esetében. Eredményeink megerősítésére az eHsp90 melanoma-specifikus membrán-interaktómját azonosítottuk FLAG-Hsp90 pull-down vizsgálatot követő MS/MS analízissel. Az így feltárt interaktóm többek között mag–citoplazma transzporthoz és vezikuláris forgalomhoz, valamint immunmodulációhoz és a sejtek inváziójához kapcsolódó fehérjéket tartalmazott, mint például a MAGEA4, a SPART és a VAPA. Az eHSP90 inhibitorok funkcionális vizsgálata során a kolonizációs kísérleteinkben a HS-10 kezelés szignifikáns csökkenést okozott a melanóma sejtek kolónia-képző képességében. Eredményeink új megvilágításba helyezik a membránhoz kötött Hsp90 szerepét melanómában, és rámutatnak olyan plazmamembrán-specifikus kölcsönható fehérjékre, amelyek a betegség előrehaladásának és a Hsp90-gátlásra adott válasznak kulcselemei lehetnek, így diagnosztikai és potenciális terápiás célpontként szolgálnak.

Témavezető: Lontay Beáta és Kinter Richárd

A daganatos sejtek túlélésében meghatározó szereppel bír a tápanyag-elérhetőség és a belső biológiai óra működése. A biológiai ritmus és a metabolizmus szoros kapcsolata ismert, a táplálkozástudomány erre vonatkozó fogalma a krononutríció. A biológiai óra farmakológiai befolyásolásának és a sejtszintű éhezésnek a kombinált hatása azonban kevésbé feltárt terület a melanóma vonatkozásában. Kutatásunk célja ezen kapcsolat vizsgálata volt egy melanóma progressziós in vitro modellben.Kísérleteinkhez általunk humán bőrből izolált epidermális melanocitákat, valamint in situ (WM35) és metasztatikus (A2058) melanóma sejtvonalakat alkalmaztunk. A sejteket 2x2 faktoriális elrendezésben kezeltük a CK1δ/ε gátló Longdaysinnel (LDS), tápanyagmegvonással kombinálva vagy anélkül. Az előzetes, 24 órás éheztetéshez SILAC RPMI 1640 Flex médiumot (glükóz, piruvát, HEPES, fenolvörös, L-arginin, L-glutamin és L-lizin nélkül) alkalmaztunk. A melanóma sejteken végzett citotoxicitási és PER2 génexpressziót feltérképező előkísérleteink a 10 µM LDS-kezelést találták optimálisnak vizsgálatainkhoz. Az életképességet MTT, a sejtproliferációt CYQUANT, az apoptózist kaszpáz, az inváziót Matrigel assay-vel mértük. A funkcionális vizsgálataink molekuláris hátterét célzott RT-qPCR panellel (MITF, p21, CCND1, BIRC5, CTNNB1, AXIN2, DKK1, LEF1, BCL2, AXL) ellenőriztük. Eredményeink alapján a tápanyagmegvonás a korai stádiumú WM35 sejtek esetében drasztikus proliferáció-csökkenést okozott, amely azonban nem járt az apoptózis fokozódásával. A molekuláris háttérvizsgálatok megerősítették, hogy a hatás hátterében a sejtciklus-gátló p21 gén expressziójának kiugró emelkedése, azaz egy erős citosztatikus hatás áll. Ezzel szemben az invazív A2058 sejtek eltérő választ mutattak, ugyanis esetükben a biológiai óra LDS általi modulációja volt szükséges ahhoz, hogy a metabolikus stressz szignifikáns mértékű apoptózist váltson ki. Az inváziós assay és az epidermális melanociták RT-qPCR eredményeinek elemzése jelenleg még folyamatban van.Összefoglalva elmondhatjuk, hogy míg a korai stádiumú melanóma sejtek egy természetes metabolikus sebezhetőséggel rendelkeznek, addig az előrehaladott stádiumban a biológiai óra farmakológiai befolyásolása szükséges a sejthalál beindításához. Eredményeink a célzott diétás megszorítások és a biológiai órát moduláló kismolekulák kombinált klinikai alkalmazásának lehetőségét vetik fel.

Témavezető: Dr. Hajdú Tibor és Katona Éva

A kiméra antigénreceptort (CAR) kifejező NK-sejtek ígéretes lehetőséget jelentenek a szolid tumorok kezelésében, köszönhetően allogén alkalmazhatóságuknak, gyors előállíthatóságuknak és kedvező biztonsági profiljuknak. Ugyanakkor a tumor mikrokörnyezet immunszupresszív hatása és a sejtek korlátozott perzisztenciája továbbra is jelentős akadályt képez hatékonyságukban. Ennek kiküszöbölésére kerültek a kutatások fókuszába az úgynevezett switch receptorok (SwR), amelyek a gátló receptor extracelluláris doménjét egy aktiváló jelátviteli doménnel kombinálják. Ezzel a logikai „jelváltással” a SwR-ek a tumor által használt gátló mechanizmusokat az immunsejt aktiválására fordítják, ezáltal elősegítve a CAR-sejtek perzisztenciájának, proliferációjának és tumorellenes hatékonyságának növelését.Korábbi munkánkban sikeresen létrehoztuk és jellemeztük a 2B4–4-1BB kostimulátor doméneket kifejező harmadik generációs HER2-CAR NK92 sejteket, amelyek kiemelkedő in vitro tumorellenes aktivitást, ugyanakkor korlátozott in vivo perzisztenciát mutattak. Ezen hiányosság kiküszöbölésére jelen vizsgálatunkban két új, PD1–IL2 és PD1–DNAM1 SwR-t hordozó HER2-CAR NK92 sejtvonal létrehozását és in vitro funkcionális jellemzését tűztük ki célul.A PD1–IL2 és PD1–DNAM1 SwR-eket in silico terveztük meg, majd a konstrukciókat megszintetizáltattuk és retrovirális vektorba klónoztuk. A laborunkban optimalizált transzdukciós rendszerrel hoztuk létre a különböző SwR-eket kifejező HER2-CAR NK92 sejteket. A receptor-expressziót áramlási citometriával igazoltuk, majd a pozitív sejtpopulációkat szortolással izoláltuk, így közel 100%-os tisztaságú, homogén és stabilan expresszáló SwR/HER2-CAR NK92 sejtvonalakat kaptunk a további funkcionális vizsgálatokhoz. A módosított sejteket konvencionális in vitro immunológiai assay-kben (citotoxicitási és citokinszekréciós tesztekben) értékeltük a tumorellenes aktivitás és funkcionális jellemzők felmérése céljából.Eredményeink szerint a SwR-t hordozó HER2-CAR NK92 sejtek rövidtávú kísérletekben a konvencionális HER2-CAR NK92 sejtekhez hasonló tumorellenes aktivitást mutattak, ami arra utal, hogy a SwR-ek beépítése nem befolyásolja hátrányosan a sejtek funkcionális hatékonyságát és élettartamát in vitro.A jövőben rechallenge és állatkísérletes modellekben tervezzük a sejtek hosszú távú aktivitásának és perzisztenciájának vizsgálatát, hogy meghatározzuk, mennyiben képesek a SwR-ek tartósan javítani a CAR NK-terápiák hatékonyságát szolid tumorokban.

Témavezető: Dr. Szöőr Árpád és Kovács Kristóf

Bevezetés: A molekuláris biológia fejlődése a CAR (Chimeric Antigen Receptor) T-sejtek révén új fejezetet nyitott a hematológiai daganatos betegségek célzott kezelésében. Az onkológiai immunterápiák következő generációját képviselő CAR-makrofágok (CAR-M) ígéretes megoldást kínálnak a szolid tumorok kezelésében, ahol a hagyományos CAR-T terápiák gyakran korlátokba ütköznek. Ezek a genetikailag módosított makrofágok nemcsak a daganatsejtek célzott fagocitózisára képesek, hanem – a tumor mikrokörnyezetbe bejutva – hatékonyan aktiválják a szervezet adaptív immunválaszát is. A jelenlegi kutatások fókuszában a makrofágok élettartamának növelése, a tumorba való infiltráció fokozása, valamint a klinikai alkalmazhatóság biztonságosságának vizsgálata áll. Viszonylag kevéssé ismertek azonban a CAR-makrofágok polarizációs sajátosságai.Célkitűzés: Vizsgálataink fő célja CAR-M sejtek polarizációs tulajdonságainak jellemzése volt, különös tekintettel az M1 irányú polarizációra és a polarizált sejtek tumorsejtekkel való interakciójára. Módszerek: Kísérleteinkben THP1 humán monocita sejteket és ezek HER2 tumorantigént felismerő és FCγR2A jelátviteli domént tartalmazó CAR-t kifejező variánsait differenciáltattunk M0 illetve M1 irányba. Több makrofág differenciációs protokoll hatékonyságát vetettük össze génexpressziós vizsgálatok és funkcionális koinkubációs kísérletek során. A makrofág differenciációra illetve polarizációra jellemző génexpressziós változásokat RT-qPCR módszerrel határoztuk meg. Koinkubációs kísérleteinkben a fluoreszcensen jelölt HER2+ SKBR3 és JIMT1 tumorsejtek életképességét, proliferációját Opera Phenix kvantitatív citometriás és képanalizáló készülék segítségével vizsgáltuk. Eredmények: RT-qPCR eredményeink szerint LPS és IFNg hatására a CAR-makrofágokban is megemelkedett az M1 irányú differenciációra jellemző gének (CD80, CD86, TNF, IL1b, STAT1) expressziója. A JIMT1 sejtek életképességét és proliferációját a CAR-t expresszáló és a normál makrofágok sem befolyásolták jelentősen. Ezzel szemben az SKBR3 sejtek esetén szignifikáns proliferációgátlás volt megfigyelhető, mely a CAR-t expresszáló makrofágok esetén még jelentősebb volt.Következtetések: A munkacsoportunk által létrehozott CAR-THP1 sejtek M1 makrofágokká differenciáltathatók és képesek szignifikánsan visszaszorítani az SKBR3 tumorsejtek proliferációját. 24 óra koinkubációt követően az FcgR2A-t expresszáló makrofágok szignifikánsan hatékonyabbnak bizonyultak a nem transzdukált makrofágoknál.

Témavezető: Prof. Dr. Virág László és Dr. Kovács Katalin

Az elmúlt évtizedben a kiméra antigén receptorral (CAR) módosított T sejtek áttörést hoztak a hematológiai malignitások kezelésében, azonban magas költségük, hosszú előállításuk és allogén alkalmazásukkor jelentkező mellékhatásaik (pl. GvHD) korlátozzák klinikai használatukat. Ígéretes alternatívát jelentenek a természetes ölősejt (NK) alapú CAR-NK terápiák, amelyek nem váltanak ki GvHD-t, így potenciálisan allogén, „off-the-shelf” formában is alkalmazhatók. Korábbi munkánk során olyan HER2-specifikus, harmadik generációs CAR-NK92 sejteket fejlesztettünk, amelyek intracellulárisan 2B4 és 4-1BB kostimulációs endodoméneket fejeztek ki. Ezek a domének kulcsszerepet játszanak az NK-sejtek aktivációjában és perzisztenciájában. Az így előállított sejtek in vitro erős citotoxikus aktivitást mutattak HER2-pozitív sejtvonalakon, de in vivo a tumorok strómájába történő penetrációjuk korlátozott maradt. Eredményeink a hematológiai daganatok elleni alkalmazás irányába terelték kutatásunkat, melyet madridi partnerünkkel, az Institute of Health Carlos III-val együttműködésben folytattunk. Jelen kísérleteinkben retrovirális transzdukcióval CD79b és/vagy BCMA specifikus, 2B4.41BB.z CAR-NK92 sejteket állítottunk elő, melyekből áramlási citometriás szortolással több, mint 95%-os tisztaságú CAR-NK92 populációkat nyertünk. A CD79b és BCMA antigének a B-sejtvonalra jellemző felszíni markerek, amelyek számos hematológiai daganatban, köztük Burkitt-limfómában és myeloma multiplexben, kiemelt terápiás célpontként jelennek meg. A CD79b- és/vagy BCMA-specifikus CAR-NK92 sejteket in vitro kokultúra kísérletekben teszteltük a mindkét antigént expresszáló RAMOS (B-NHL) sejtvonalon, míg negatív kontrollként a CD79b- és BCMA-negatív K562 (CML) sejtvonalat alkalmaztuk. Az IFN-γ ELISA assay eredményei magas fokú, antigénfüggő CAR-specifikus aktivációt jeleztek, amit megerősített, hogy a rövid távú citotoxicitási vizsgálatokban minden vizsgált CAR-NK92 sejtkészítmény hatékonyan és reprodukálható módon eliminálta a RAMOS célsejteket, igazolva a konstrukciók funkcionális specificitását és erőteljes tumorellenes potenciálját. Eredményeink alátámasztják, hogy a CD79b- és/vagy BCMA-specifikus CAR-NK92 sejtek ígéretes platformot kínálnak B sejtes malignitások célzott immunterápiájához. Távlati célunk a konstrukciók hatékonyságának és biztonságosságának in vivo validálása egérmodellekben, valamint azok transzlációs potenciáljának értékelése jövőbeli klinikai fejlesztések irányába.

Témavezető: Dr. Szöőr Árpád és Gergely Bence

A protein kinázok és foszfatázok aktivitásának eltolódása a fehérjék szélsőséges foszforilációs állapotait eredményezik. A protein foszfatázok gyakran tumorszupresszorként hatnak, így fokozott gátlásuk, mutációjuk vagy a kifejeződésük csökkenése onkogén jelátviteli folyamatokat indít el. Az egyik kulcsfontosságú génexpressziót is szabályozó enzim a miozin foszfatáz (MP), amely egy MYPT1 szabályozó és egy PP1c katalitikus alegységből áll. A holoenzim gátlását a MYPT1 alegység Thr853 oldalláncának foszforilációja okozza, melyet többek között a Rho-dependens kináz (ROK) foszforilál. Korábban igazoltuk már a MP és a tumorszupresszorként leírt Mg2+-függő protein foszfatáz 1B (PPM1B) kölcsönhatását. Ezek alapján vizsgálni kívántuk a PPM1B szerepét a MYPT1 Thr853 oldalláncának szabályozásában és annak hatásait HeLa sejtekben. Duolink Proximity Ligation és aktivitásmérési vizsgálat segítségével igazoltuk a MYPT1 a PPM1B szubsztrátja, és annak aktivitását növeli a MYPT1 Thr853 oldallánc defoszforilációjával. NT-FT-PPM1B overexpresszióját követő immunfluoreszcens festéssel igazoltuk, hogy a PPM1B emelkedett szintje a MYPT1 gátló foszforilációjának csökkenését és citoplazmatikus transzlokációját okozta. Az emelkedett citoplazmatikus MYPT1 expresszió a MP szubsztrátjának, a 20 kDa miozin könnyűlánc foszforilációs szintjének csökkenését idézte elő. A PPM1B overexpresszió hatására megváltozott miozin foszforiláció a sejtek invázióját gátolta. A gátolt inváziós képesség mögött húzódó proteom szintű változások feltérképezése érdekében Proteome Profiler Human Oncology Array-t alkalmaztunk. Segítségével számos csökkent expressziót mutató extracelluláris mátrix proteázt és egy emelkedett expressziójú proteáz inhibitort, a Maspint azonosítottuk. Eredményeink alapján elmondható, hogy a PPM1B a MP aktivitásának szabályozásán keresztül hatással van a daganatsejtek inváziójára, így fontos terápiás célpontként szolgálhat.

Témavezető: Dr. Lontay Beáta és Ungvári Ádám

A méhnyakrák Magyarországon az egyik leggyakoribb daganatos megbetegedés a nők körében, mely kialakulásában, progresszójában a humán papillomavíruson kívül több ioncsatorna szerepét is igazolták. A humán feszültségfüggő protoncsatorna (hHv1) overexpresszióját figyelték meg több daganatos/tumoros sejttípusban. Hypoxiás körülmények között a hHv1 gyorsan képes protonokat eltávolítani a citoszolból, így hozzájárulhat a sejtek tumor mikrokörnyezethez való alkalmazkodásához. A hHv1 diagnosztikus és prognosztikus jelentőségét írták le emlő és vastagbél karcinómában is, így azt reméljük, hogy a hHv1 ioncsatorna akár mint tumor marker, akár mint potenciális terápiás célpont is ígéretes lehet a méhnyakrák esetében.Ezért célul tűztük ki, hogy HPV 16 pozitív SiHa, CaSki, és HPV 18 pozitív HeLa cervix karcinóma sejtvonalakban tanulmányozzuk a hHv1 rövid és hosszú izoformájának expresszióját, illetve olyan áramlási citometriás módszert terveztünk optimalizálni, ami akár a rutin diagnosztikában is alkalmazható lenne sejtkefével levett citológiai mintákon.A vizsgálatokhoz a humán cervix karcinóma sejtvonalakat használtunk. A hHv1 mRNS expresszióját reverz transzkripciós (RT) PCR-rel vizsgáltuk. A fehérjék detektálására Western blott technikát és immunfluoreszcens jelölésen alapuló áramlási citometriát alkalmaztunk. Az áramlási citometriás mérések során az epitheliális sejtek azonosításához anti-EPCAM és Pan reaktív anti-CK antitesteket használtunk. A hHv1 különböző izoformáinak azonosításához két antitestet használtunk, az egyik mind a hosszú, mind a rövid izoformához tud kötődni, míg a másik csak a hHv1 hosszú izoformájára specifikus. mRNS szinten az 1-es és 2-es transzkripciós variáns mind a HeLa, SiHa, CaSki cervix karcinóma sejtvonalban kimutathatók voltak. Mindhárom sejtvonalban kimutattuk a hHv1 ioncsatornafehérjét Western blot technikával. A hHv1 izoforma-függő expressziójának meghatározásakor azt mutattuk ki, hogy a Hv1-nek csak a hosszú izoformája fejeződik ki a HeLa, SiHa és CaSki sejtvonalakban. Továbbá olyan áramlási citometriás módszert fejlesztettünk, ami akár a heterogén citológiai mintákon is alkalmazható lehet az epitheliális sejtek hHv1 expressziójának kimutatásához.Eredményeink azt mutatják, hogy a cervix karcinóma sejtvonalakban kifejeződik a hHv1. Érdemes lehetne tehát méhnyakrákos betegek citológiai mintáiban is tanulmányozni, mivel akár tumor markerként vagy terápiás célpontként szolgálhat a méhnyakrák diagnosztikájában, kezelésében.

Témavezető: Dr. Arnódi-Mészáros Beáta és Dr. Óvári Krisztián László