OETDK.

A vázrendszeri rendellenességek jelentős terhet rónak a társadalomra. Jelen kutatás kiindulópontja, hogy a porcszövet kialakulása során a mesenchymalis őssejtek (MSC), illetve az érett chondrocyták metabolikus szempontból eltérőek. A porcszövet ereket nem tartalmazó szövet, ahol hipoxiás viszonyok uralkodnak, és az érett chondrocyták anyagcseréjére elsősorban az anaerob útvonalak dominanciája jellemző. A chondrogenezis során a metabolikus útvonalak jelentős átalakuláson esnek át, ennek pontos mikéntjéről azonban jelenleg hiányosak az ismereteink, ezért arra kerestük a választ, hogy a porcszövet fejlődése során hogyan változnak az anyagcsere-útvonalak a differenciálódó porcsejtekben.A porcdifferenciáció modellezéséhez csirkeembriók végtagtelepjeiből izolált mesenchymalis sejtekből előállított micromass sejtkultúrákat használtunk. A spontán porcosodó kultúrákat 15 napig tartottuk fent. A kultúrákon transzkriptomikai analízist (RNA-seq), kvantitatív proteomikát (LC-MS/MS), funkcionális metabolikus fluxot (Seahorse XF Mito Stress), mitokondriális morfológiát (Mitotracker festés), mátrixtermelést (DMMB festés), viabilitást (MTT) vizsgáltunk, a porcspecifikus gének expresszióját pedig qRT-PCR-ral értékeltük. Az anyagcsere-útvonalakat különböző inhibitorokkal (a glikolízist 2-D-glükózzal, az ATP-szintézist oligomicinnel) gátoltuk. A porcdifferenciáció mértékét csökkentett glükóztartalmú médiumban történő tenyésztést követően vizsgáltuk.Eredményeink alapján a differenciációs folyamat során alkalmazott csökkentett glükóztartalmú, illetve metabolikus inhibitorokat tartalmazó médium különböző módon gátolta a porcdifferenciáció folyamatát, azonban a tenyésztés vége felé alkalmazott csökkentett glükóztartalmú környezet fokozta a porcképződés mértékét, amelyet metakromáziás festéssel és a génexpresszió szintjén is sikerült kimutatnunk. A glikolitikus enzimek expressziója (pl. LDHA, PKLR) fokozatosan emelkedett, jelezve Warburg-shiftet, míg TCA-enzimek (pl. IDH2) és mitokondriális komplexek (IV-V) stabilan csökkentek. Seahorse mérések domináns ECAR-t és csökkent OCR-t mutattak az érett kultúrákban, glikolitikus fenotípust igazolva.Az integrált omikai adatok dinamikus glikolitikus átállást mutatnak porcdifferenciáció során. A csökkentett glükóztartalmú környezet elősegítheti az érett porcsejt-fenotípus kialakulását. Mindezek új terápiás célpontokat kínálhatnak az osteoarthritis terápiája során, és hozzájárulhatnak a porcregenerációs eljárások hatékonyságának növeléséhez.

Témavezető: Dr. Matta Csaba és Dr. Hajdú Tibor

A tüdődaganat a leggyakoribb felnőttkori primer daganattípus, amely az esetek körülbelül felében agyi metasztázissal (AM) társul. A tüdő adenokarcinóma (TA) a nem kissejtes tüdőrák leggyakrabban előforduló altípusa, amely magas áttétképződési hajlammal rendelkezik. Ezzel szemben a glioblasztóma (GBM) egy agresszív primer agydaganat, amely a felnőttkori agytumorok több mint 60%-át teszi ki. Jól ismert, hogy a GBM és a TA-AM morfológiai megjelenése számos esetben hasonlóságot mutat a konvencionális MRI felvételeken. Ezért kiemelten fontos olyan új biomarkerek azonosítása, amelyek segítségével a különböző agydaganattípusok megbízhatóan elkülöníthetők. A miRNS-ek daganatok diagnosztikájában betöltött szerepét széles körben vizsgálják, így az eltérő miRNS-expressziós mintázatok feltárása ígéretes lehetőséget kínál.Célunk egy olyan miRNS-panel azonosítása volt, amely megbízhatóan megkülönbözteti a TA-AM, a GBM és az ép agyszövet mintákat az eltérő expressziós mintázatok alapján.Az Illumina NextSeq 500 platformot (UD Genomed) alkalmazva 6 TA-AM, 6 GBM és 6 ép agyszövet miRNS-expressziós mintázatát vizsgáltuk Új Generációs RNS-szekvenálással. A totál RNS izolálását a miRNeasy Mini Kit protokollja szerint végeztük el. A kapott RNS-seq adatokat az IDEP.96 szoftverrel dolgoztuk fel, míg a miRNS-központú hálózatelemzést a miRNet-tel végeztük. Az NGS-eredmények alapján azonosított, szignifikáns expressziós különbséget mutató miR-375-3p, miR-200a-5p, miR-9-5p és miR-410-3p expresszióját RT-qPCR-rel (miRCURY LNA SYBR Green Kit – Qiagen) további 30–30 szövetmintán validáltuk. A statisztikai különbségek értékelését Mann–Whitney U teszttel, míg a diagnosztikai hatékonyságot EasyROC programmal határoztuk meg.Az RNS-seq elemzés 229 differenciálisan expresszálódó (DE) miRNS-t azonosított a TA-AM és az ép minták között, valamint 46-ot a TA-AM és a GBM összehasonlításában. A funkcionális annotáció alapján ezek a DE miRNS-ek a daganatképződés és a metasztázis fontos szabályozói. Az RT-qPCR-ral történő validálásra kiválasztott 2 upregulált (miR-375-3p, miR-200a-5p) és két downregulált (miR-9-5p és miR-410-3p) miRNS esetén igazoltuk, hogy szignifikáns különbséget mutatnak a TA-AM, GBM és kontroll minták között (p < 0,0001). Továbbá meghatároztuk a diagnosztikai hatékonyságukat (AUC > 0,8).Összegzésképpen elmondható, hogy potenciális biomarkerként egy négy miRNS-ből álló panelt sikerült összeállítanunk, amely lehetővé teszi a két vizsgálati csoport megbízható elkülönítését.

Témavezető: Dr. Birkó Zsuzsanna és Torner-Korpai Bernadett

Az ízületi gyulladás (osteoarthritis, OA) jelentős terhet ró az egészségügyi ellátásra. Mindezek ellenére eddig még nem sikerült nagy hatékonyságú gyógyszeres vagy fizioterápiás kezelést kifejleszteni. Az ízületi porc egészséges szerkezetének fenntartásához szükséges bizonyos biomechanikai ingerek jelenléte. Arról azonban jelenleg korlátozottak az ismereteink, hogy a földitől eltérő gravitációs tér milyen hatást gyakorol az egészséges, valamint a károsodott, osteoarthritises porcsejtekre.Kísérleteinkhez emberi ízületi porcszövetből izolált primer egészséges és OA porcsejteket használtunk fel. A sejtkultúrákat szimulált mikrogravitációs környezettel (Airbus RPM 2.0) kezeltük 96 órán keresztül. A porcsejtek életképességét MTT assay segítségével, eloszlásukat és morfológiájukat pedig hematoxilin-eozin (HE) szövettani festéssel vizsgáltuk. A porcsejtekből RNS-t izoláltunk, majd a génexpressziós profiljuk feltérképezéséhez RNS szekvenálást alkalmaztunk. Az eltérő kifejeződésű géneken Gene Ontology (GO) és KEGG-pathway analíziseket végeztünk.Mind az egészséges, mind a pathológiás porcsejtek mitokondriális aktivitása csökkent a mikrogravitációs kezelés hatására. A HE festett, egészséges kultúrákban alacsonyabb sejtsűrűséget láthattunk a kezelést követően, az OA porcsejtek esetén azonban nem tapasztaltunk eltérést. A mikrogravitáció hatására az egészséges chondrocytákban 376 gén, az OA porcsejtekben pedig 384 gén expressziója változott meg a kontroll körülményekhez képest. A GO és a KEGG-pathway analízisek az egészséges chondrocyták esetén elsősorban a cirkadián ritmusban bekövetkezett változásra hívta fel a figyelmünket. Az OA porcsejtek tekintetében mérséklődött a csontosodással összefüggő gének, és emelkedett a kollagének expresszióját befolyásoló gének kifejeződése.Az MTT assay és a HE szövettani festés eredményeiből arra következtethetünk, hogy az egészséges porcsejtek igénylik a földi gravitáció által okozott biomechanikai erőhatásokat, ezzel ellentétben az OA porcsejtek ezen igénye csökkent a pathológiás átalakulás során. Az egészséges porcsejtek esetén bekövetkezett génexpressziós változás jelentheti a sejtek időbeli érzékenységét az ízületeket ért különböző mechanikai erőkre. Ezzel szemben az OA porcsejtek fokozták a kollagénszintézist, ugyanakkor mérsékelték a betegségre jellemző csontosodási folyamatokat, mely eltérések felhívják a figyelmet a mikrogravitációs tér esetleges jövőbeli alkalmazhatóságára az osteoarthritis gyógyászatában.

Témavezető: Dr. Kovács Patrik és Dr. Matta Csaba

A petefészekrák az egyik legsúlyosabb prognózisú daganattípus a nők körében. A leggyakrabban előforduló epitéliális típus további 5 altípusba sorolható, amelyek a patofiziológiai jellemzőik és terápiára adott válaszuk tekintetében nagyban különböznek. Munkánk során célunk a két legyakoribb, a magas grádusú szerózus és az endometrioid típusba sorolható PEO1 és A2780 sejtvonalak H2O2 által indukált sejthalálra adott válaszának összehasonlítása volt.Kísérleteink során a sejtvonalakat H2O2 kezelésnek vetettük alá (50-1000 µM), majd az életképesség változását MTT teszttel határoztuk meg. A génexpresszióban megmutatkozó globális változásokat RNS szekvenálással (Illumina Nextseq 500) monitoroztuk. Néhány gén expresszióját RT-qPCR segítségével is detektáltuk.Eredményeink alapján az A2780 sejtvonal kevésbé tolerálta a H2O2 kezelést, az életképesség csökkenése már 50 µM koncentráció hatására jelentkezett, de 500 µM dózis alkalmazásakor már mindkét sejtvonalban intenzív sejthalál volt jellemző. Transzkriptomikai elemzésünk során 500 µM kezelés hatására intenzív, a génexpresszióban megfigyelhető változásokat detektáltunk: a PEO1 sejtvonalban 932, míg az A2780 esetében 521 gén transzkripciója változott meg (Log2FC≥1, vagy Log2FC≤1). A két sejtvonal esetében indukciót, illetve repressziót mutató gének közötti átfedés alacsony volt, az 87-nek és 27-nek adódott. A transzkriptomikai adatsort 25 gén RT-qPCR-es vizsgálatával validáltuk. A szekvenálás és az RT-qPCR során kapott Log2FC értékek között magas korreláció volt megfigyelhető (PEO1: r=0,97; A2780 r=0,91). Az indukálódott gének géndúsulási analízise alapján az A2780 sejtvonalban elsősorban a sejthalálhoz és a stresszválaszhoz köthető folyamatok mutattak indukciót, melyek közül a CDKN1A, BTG2, BBC3, PLK3, ATF3 és FOS gének indukcióját RT-qPCR segítségével is megerősítettük. A PEO1 esetében azonban az apoptózisindukálódása kevésbé volt hangsúlyos, ebben a sejtvonalban a citokinek termeléséhez és hatásához köthető útvonalak nagymértékű indukálódását tapasztaltuk. A CDKN1A, BTG2, CXCL2, CCL20, EGR1, és FOS gének dózisfüggő indukciója RT-qPCR-rel is detektálható volt.Eredményeink alapján a citokin termelés elindulása hozzájárulhat az ovárium tumorok túléléséhez. A citokintermelés gátlása és az oxidatív stressz indukciója kombinált terápiás stratégiaként ígéretes alternatíva lehet petefészekrákban.A munka az FK138021 pályázat és a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj támogatásával készült.

Témavezető: Dr. Szilágyi-Bónizs Melinda és Domoszlai Dóra

A mikroRNS-ek (miRNS) olyan kis, nem-kódoló RNS molekulák, amelyek közreműködnek a sejtproliferáció és a sejthalál szabályozásában, ezáltal hatást gyakorolnak a tumorok progressziójára és terápiára adott válaszára. Munkánk során célunk olyan miRNS-mRNS kapcsolatok azonosítása volt, amelyek meghatározóak az ovárium sejtek sejthalálának szabályozásában, ezáltal ígéretes terápiás alternatívát képviselhetnek petefészekrákban.Két sejtvonalat alkalmaztunk: a PEO1-et (TP53, BRCA2 mutáció), amely jobban tolerálja a sejthalált kiváltó kezeléseket (pl. H2O2), ill. az A2780-at (ATM, PTEN mutáció), amely érzékenyebben reagál azokra. A két sejtvonal mRNS és miRNS szekvenálási adatsorát (Illumina Nextseq 500) összehasonlítva olyan miRNS-eket és mRNS-eket kerestünk, amelyek expressziós különbsége ellentétes és feltételezhető a sejthalálban betöltött szerepük (iDEP2.0, miRNet, miRTargeltLink, Reactome segítségével). Eredményeinket RT-qPCR-el és antimiR alkalmazásával validáltuk.Első lépésben a PEO1 és A2780 sejtvonalak esetében mRNS szekvenálást végeztünk, majd azonosítottunk 740 olyan gént, amely az A2780-ban rendelkezett nagyobb expresszióval (Log2FC≥2). Az adatsort 12 gén RT-qPCR-es vizsgálatával validáltuk. A szekvenálás és az RT-qPCR-rel kapott Log2FC értékek közötti korreláció magas volt (r=0,92). A kapott mRNS-eket összevetettük azon miRNS-ekkel, amelyek a PEO1-ben mutatnak magasabb expressziót (Log2FC≥5). A kapott hálózatban (miRNet, Shortest path filter) a CDKN1A (deg: 39, btw: 170.4788) és az ARID3A (deg: 36, btw: 120.0347) gének, valamint a let-7b-5p miRNS (deg: 32, btw: 494.1311) kiemelkedő szerepe valószínűsíthető. A let-7b-5p lehetséges targetjei közül 42 expressziója mutatott magasabb szintet az A2780 sejtvonalban, amelyek nagyfokú dúsulása volt megfigyelhető a sejthalál folyamatában. A PEO1-ben magasabb let-7b-5p, valamint alacsonyabb CDKN1A és ARID3A expressziót RT-qPCR-el is megerősítettük. A PEO1 sejtvonalban a let-7b-5p antimiR-el való gátlása dózisfüggő módon csökkentette a sejtek életképességét, növelte a CDKN1A és ARID3A expresszióját, valamint érzékenyebbé tette a PEO1 sejteket a H2O2 által kiváltott sejthalállal szemben.Eredményeink alapján a let-7b-5p közreműködhet a CDKN1A és ARID3A expressziójának finomhangolásán keresztül a sejthalál szabályozásában. Gátlása ígéretes terápiás opció lehet TP53 mutációval rendelkező ovárium tumorok esetében is.A munka az FK138021 pályázat és a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj támogatásával készült.

Témavezető: Dr. Szilágyi-Bónizs Melinda és Domoszlai Dóra

Alternative splicing (AS) acts as a crucial regulatory mechanism, creating multiple protein isoforms to adjust cellular functions in response to environmental challenges. Chinese Hamster Ovary (CHO) cells are the industrial standard for recombinant protein production, a process that places a heavy burden on the endoplasmic reticulum (ER). Consequently, the transition from exponential growth to the stationary phase of producer cell lines is often characterized by activation of the adaptive ER stress response. While it is known that ER stress influences splicing factor activity, the landscape of splicing changes during this specific production window remains largely unclear. Here, we investigated AS dynamics detected by RNAseq, driven by culture progression in recombinant protein producer CHO cell lines. We utilized a discovery-oriented alignment approach (STAR 2-pass and StringTie) to detect known and unannotated junctions, followed by DESeq2, IsoformSwitchAnalyzeR and DEXSeq bioinformatics analysis pipelines to identify genes with novel splice variants or significant changes in AS. Next, a stringent filtering based on mean expression, adjusted p-value and fold change was combined with manual curation using the Integrative Genomics Viewer (IGV) to assess coverage, structural validity, and novelty of the AS events, based on Ensembl and NCBI annotations. This analysis highlighted 15 known protein coding genes that display clear, novel splicing events with predicted functional consequences. Four genes have been selected as priority targets for experimental validation via real-time quantitative RT-PCR, based on their functions as transcriptional regulators (Elk3, Hnf4a), and/or their known roles in the ER stress response (Oga, Hnf4a and Slc7a11). Our findings are expected to contribute to a better understanding of how alternative splicing shapes the adaptive ER stress response during recombinant protein production of CHO cells.

Témavezető: Dr. Scholtz Beata

Antibiotic resistance is an increasingly significant challenge in public health, particularly due to multidrug-resistant bacterial strains in clinical settings. This study explores bacteriophages as a potential alternative or complementary approach to conventional antibiotics. Bacteriophages, viruses that infect bacteria, also play an important role in horizontal gene transfer (for example through generalised or specialised transduction) which raises questions about their genomic stability and safety during therapeutic use. In this study, we examined the genetic stability of isolated phage suspensions over eight sequential generations. Long-read whole-genome sequencing was performed using the Oxford Nanopore platform, and the resulting genomes were compared generation by generation to detect single-nucleotide variants (SNVs) and other mutational changes. Our findings provide insight into the extent of genomic variability in three bacteriophage strains during serial propagation and highlight considerations for the future development of phage-based antimicrobial strategies.

Témavezető: Dr. Freytag Csongor