OETDK.

Az osteoarthritis (OA) a leggyakoribb ízületi betegség típus,mely világszerte több, mint 500 millió embert érint. Jelenleg nincs lehetőség az OA megbízható, korai diagnózisára, sem pedig hatékony gyógyszeres kezelésére. Az FDA által elfogadott új gyógyszerek közel 70%-a sejtfelszíni fehérjéken fejtik ki hatásukat, melyek a proteom egyik alcsoportját, a „surfaceome”-ot alkotják. Ezen okokból kifolyólag célul tűztük ki a porcsejteken található sejtfelszíni fehérjék új, hálózatalapú vizsgálatát, és a megfelelő biomarkerek kiválasztását, melyek elősegíthetik a pontos és korai diagnózisalkotást, valamint új terápiák kidolgozását.Kísérleteinkhez humán ízületi porcszövetből izolált primer egészséges és OA porcsejteket használtunk fel. A fiziológiásabb környezet megteremtéséhez a sejteket low-glucose médiumban, valamint hypoxiás (~2% O2 szint) inkubátorban tenyésztettük. A sejtfelszíni fehérjék izolálásához aminooxy-biotin (AOB) alapú technikát használtunk, majd a kinyert peptidmintákat, valamint párhuzamosan a teljes sejtlizátumot kvantitatív tömegspektrometriai módszerrel vizsgáltuk. A nyers adatokon a SurfaceGenie adatbázis segítségével szűrést végeztünk, majd Gene Ontology és KEGG-pathway hálózatelemzést alkalmaztunk.Proteomikai eredményeinkben összevetettük az AOB által izolált és a total proteom listában szereplő fehérjéket. Az egészséges porcsejteknél 35, míg az OA chondrocytáknál 34 olyan fehérjét azonosítottunk, ami csak az AOB listában szerepelt. A normál és OA sejtek AOB mintáiban a SurfaceGenie 48%- és 43%-ban azonosított sejtfelszíni fehérjéket. A szűrést követően összehasonlítottuk a két sejttípust, melynek során 40 sejtfelszíni protein csak az egészséges, míg 30 sejtfelszíni fehérje kizárólag az OA porcsejtekben volt detektálható. Az in silico validált sejtfelszíni fehérjék és a hozzá tartozó total proteom felhasználásával végzett hálózatelemzés a normál sejteken elsősorban az integrin jelátvitelt és vesicularis transzportot, az OA sejtek esetén pedig az EGFR jelátvitelt és különböző metabolikus útvonalakat emelte ki.Az integrin jelátvitel szerepének csökkenése, valamint a metabolizmus átrendeződése az OA porcsejtekben egybecseng az irodalommal. Az OA porcsejtek felszínén található specifikus sejtfelszíni biomarkerek (DDR2, IGSF8) azonosítása új lehetőségeket teremthetnek az egészséges és pathológiás sejtek elkülönítésére, mely tudás felhasználható akár a diagnosztikában, akár a szövettervezést követő sejt alapú terápiák kivitelezésében.

Témavezető: Dr. Kovács Patrik és Dr. Matta Csaba

A peroxiszóma proliferátor által aktivált receptorok (PPARok) a magreceptorokhoz tartoznak, három izoformájuk ismert: PPARα, PPARβ/δ és PPARγ. Kutatásunk a PPARβ/δ-ra fókuszál, amely retinoid X receptorral (RXR) heterodimert alkotva, célgénjeit endogén ligandokra és szintetikus agonistákra válaszul szabályozza. A PPARβ/δ fontos szerepet tölt be a sejtek lipid anyagcseréjében, a tumorsejtekben fokozott expressziója hozzájárulhat a daganatprogresszióhoz, ugyanakkor a PPARβ/δ jelentősége HER2-pozitív emlőráksejtekben nem tisztázott.Kísérleteink célja a PPARβ/δ GW501516 ligand általi aktivációja volt SKBR3 HER2-pozitív emlőtumor sejtvonalon, különös tekintettel a lipid metabolizmusban, sejtproliferációban és a génexpressziós mintázatban bekövetkező változásokra. Vizsgáltuk a GW501516 szelektív PPARβ/δ és az LG100268 szelektív RXR agonista egyedi és kombinált hatását is.A sejtek proliferációját PrestoBlue-alapú viabilitásméréssel, valamint sejtszámláláson alapuló proliferációs assay vizsgálattal elemeztük. A sejtekben GW501516 hatására bekövetkező metabolikus változások igazolására a lipidfelhalmozódást LipidTox festéssel, fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. A transzkripció szintű változások elemzésére NGS alapú RNS-szekvenálást végeztünk, amely alapján a differenciálisan expresszálódó géneket azonosítottuk a GW501516 és LG100268 kezelt minták között. Az eredményt a Galaxy szerverével elemeztük, az így kapott differenciálisan expresszálódó gének listáján pathway analízist futtatunk. A PPARβ/δ jelátvitel célgénjeinek az expresszióját kvantitatív PCR-rel elemeztük. A fehérjeszintű változások követésére Western-blot analízist alkalmaztunk. Az eredmények azt mutatták, hogy a GW501516 PPARβ/δ agonista fokozta a proliferációt, míg az LG100268 kezelés csökkent sejtszámot eredményez három napos inkubációt követően. RNS szekvenálás megmutatta, hogy a PPARβ/δ és az RXR aktiváció hatására számos gén differenciáltan fejeződik ki. Ugyanakkor az RXR receptor aktiválása mérsékelten, a PPARβ/δ erőteljesebben, míg a két agonista együttes alkalmazása jelentősen fokozta a PPARβ/δ jelátvitel egyik ismert célgénje, az ANGPTL4 expresszióját. A fehérjeszinten vizsgált PRDX1, annexinA1 fehérjék mennyiségének változásai GW501516, LG100268, illetve kombinált kezelés hatására azonban a szinergia irányába mutattak. Az eredményeink alapján megállapítható, hogy a PPARβ/δ magreceptor aktiválása kulcsfontosságú szerepet tölthet be az HER2-pozitív emlőráksejtek progressziójában.

Témavezető: Dr. Uray Iván Péter

Az emlődaganat a leggyakrabban előforduló daganattípus a nők körében. A betegség hátterében álló molekuláris mechanizmusok rendkívül összetettek; jelen kutatás a katekolamin jelátviteli út szerepének feltárását célozza. A szervezetben a katekolaminok bioszintézisének helye elsődlegesen a mellékvese, azonban számos irodalmi adat támasztja alá, hogy egyéb szövetek is képesek katekolamin termelésre. Munkacsoportunk előzetes eredményei alapján emlődaganatos betegek és emlőtumorral oltott egerek vizeletében egyaránt emelkedett katekolamin szint mutatható ki. Irodalmi adatok arra engednek következtetni, hogy az ismeretlen forrásból származó katekolamin túltermelés elősegítheti az emlődaganat progresszióját.A katekolamin túltermelés szerepének felderítésere humán emlődaganat sejteket a katekolamin szintézis útvonal első enzimét, a tirozin hidroxilázt (TH) gátló metirozinnal kezeltünk és immunfluoreszcens módszerrel vizsgáltuk a sejtek morfológiáját, aktin struktúráját, valamint az epitheliális mezenchimális tranzíció (EMT) folyamatában szerepet játszó markergének expresszióját qPCR módszerrel. A markerek fehérjeszintű expresszióját Western blot módszerrel erősítettem meg.Immunfluoreszcens vizsgálataink alapján feltártuk, hogy metirozin kezelést követően a tumoros sejtek megnyúlt morfológiája kerekebbé változott. A stresszkábelek száma csökkent, miközben a kortikális aktin intenzívebb struktúraként volt megfigyelhető. Kimutattuk azt is, hogy a TH farmakológiai gátlása csökkenti a mezenchimális markerek (Vimentin, Snail, TCF7L2) expresszióját, emellett növeli az epiteliális gének (β-catenin) kifejeződését is, ami az EMT gátlására utal.

Témavezető: Dr. Tóth Emese és Prof. Dr. Bay Péter

A stresszgranulumok (SG) stresszhatásra a transzláció részleges leállását követően a citoplazmában megjelenő membránnélküli organallumok. Dinamikus önszerveződéssel állnak össsze, ahogy a szabaddá váló RNS-ek, RNS-kötő és egyéb fehérjék többirányú, alacsony affinitású interakciója folyadék a folyadékban fáziselkülönülést hoz létre. Szerepük csak részben tisztázott: az RNS-ek védelme stressz alatt, ill. bizonyos jelátviteli útvonalak szabályozása. Összefüggésbe hozhatók neurodegeneratív betegségekkel, daganatokkal és vírusok elleni védelemmel. Az ADP-ribozil-transzferázok (ART) fehérjéken vagy RNS-en mono- vagy poli-(ADP-ribóz) (PAR) módosítást létrehozó enzimek. Többek között az RNS-biológia fontos szereplői: szabályozzák a splicingot, a riboszóma működését, a transzlációt. Mivel az SG-k nem egy ART-ot tartalmaznak, a PAR egyszálú nukleinsavszerű molekula, valamint számos ART hordoz RNS- és PAR-kötő domént, kiváncsiak voltunk, lehet-e ezeknek az SG-kben architektúrális vagy szabályozó szerepe.A SG-k kialakulását egy G3BP1-EGFP fehérjét expresszáló U2OS sejtvonalban követtük NaAsO2 kezelést vagy duplaszálú RNS transzfekciót követően. Immunfluoreszcencia és konfokális mikroszkópia segítségével kimutattuk, hogy a PAR és számos ART kolokalizál az SG-kkel. Az ARTD4 és 11, és az RNF146 PAR-függő E3-ligáz jelenlétét a granulumokban elsőként figyeltük meg. Ezt megerősítettük SG magok izolálása, ill. egy G3BP1-APEX2-EGFP-t expresszáló sejtvonalon biotin proximity labeleing majd western blot segítségével is. Hogy az ADP-riboziláció szerepét megértsük az SG-k kialakulásában, a G3BP1-EGFP sejteket különböző ART inhibitorokkal kezeltük, és az SG-k méretét, számát és morfológiáját szoftveresen elemeztük. A széles spektrumú PARP inhibitor PJ-34 hatására a sejtekben nagyobb számú kisebb granulum, míg a poli(ADPribóz)-glikohidroláz gátlószer, PDDX-001 hatására kevesebb és nagyobb granulum volt megfigyelhető. A SG-k belső dinamikáját és a környezetükkel történő anyagkicserélését FRAP és iFRAP módszerrel vizsgáltuk. Cas9-t és sgRNS-t expresszáló lentivírus segítségével több ART gént inaktiváltunk U2OS sejtekben, melyek egyenkénti kiütése nem volt hatással az SG-k képződésére. Eredményeink alapján az ADP-riboziláció a ribonukleoprotein kondenzátumok fluiditásának modulátora. Feltételezzük, hogy a mono-ART-ok működése redundáns és a PAR láncok kezdeményinek elhelyezése lehet. Munkánk az SG-ken belüli PAR későbbi funkcionális tanulmányozásának alapja.

Témavezető: Dr. Demény Máté és Prof. Dr. Virág László

A jelátviteli molekulák foszforilációs és defoszforlizációs állapotának megfelelő aránya elengedhetetlen a sejt homeosztázisának fenntartásához. Ez az egyensúly protein kináz és foszfatáz enzimek által szabályozott. Ezen enzimek expressziós szintjének, illetve aktivitásának megváltozása a tumorgenezis és -progresszió kulcslépése. Az egyik ilyen onkogén jelátviteli útvonal a miozin foszfatáz (MP)/protein arginin metiltranszferáz 5 (PRMT5)/hiszton (H4) útvonal, amely a hiszton fehérjék szimmetrikus dimetilációja által egyes tumorszupresszorok génexpressziójának csökkenését eredményezi. Az útvonal upstream szabályozó elemei azonban még nem ismertek. A MP MYPT1 szabályozó alegységével történő pull down vizsgálatot követő proteomikai elemzéssel sikerült kimutatnunk a Mg2+-függő protein foszfatáz 1 B (PPM1B) enzimet, mint lehetséges kölcsönható fehérjét. A fehérje-fehérje kölcsönhatást DuoLink Proximity Ligation esszével is igazoltuk HeLa sejtekben. A PPM1B specifikus gátlószerével, a Sanguinarine-nal (SNG) történő kezelés a MP inaktivációját okozta, amelyet a MYPT1 gátló Thr850 foszforiláció Western blot elemzésével és a sejtlizátumok miozin foszfatáz aktivitásmérésével igazoltunk foszforilált miozin könnyű lánc szubsztráttal. Az SNG kezelés a PRMT5 Thr80 aktivációs foszforilációjához vezetett, amely növekvő szimmetrikus H4 hiszton dimetilációt eredményezett. A sejtvonalon nyert adatainkat humán betegmintákon is igazoltuk Western blot analízissel. Az egészségeses és cervix carcinoma biopsziák össehasonlítása, a PPM1B közel teljes eliminációját mutatta a daganatos szövetekben. A MYPT1pT850 gátló, a PRMT5pT80 aktivációs oldalláncainak szintje szignifikánsan nőtt, továbbá a H4 hiszton szimmetrikus dimetilációjának mértéke is. Ezek alapján a PPM1B/MP enzimek tumorszuppresszor szereppel bírnak azáltal, hogy gátolják a PRMT5 enzimet. A PPM1B ígéretes tumormarkernek bizonyulhat cervikális daganatokban.

Témavezető: Dr. Lontay Beáta és Dr. Keller Ilka

Az antimikrobiális rezisztencia megjelenésében és terjedésében is jelentős szerepet játszhatnak a probiotikum-készítményekben megtalálható baktériumtörzsek. Ennek a veszélye, hogy horizontális géntranszfer következtében adhatnak át rezisztencia géneket kórokozó baktériumok számára is. Vizsgálatunk célja nyolc különböző probiotikum-készítményben megtalálható valamennyi baktériumtörzs antibiotikum rezisztencia profiljának meghatározása volt. Feltételeztük, hogy az általunk vizsgált probiotikum-készítmények baktériumtörzsei, hordozhatnak - a humán gyógyászatban, gyakran alkalmazott - antibiotikumokkal szembeni ellenállóságot biztosító rezisztencia géneket. Magyarországon jelenleg is kereskedelmi forgalomban kapható, nyolc különböző probiotikum-készítmény in vitro laboratóriumi vizsgálata során: elvégeztük a készítményekben található 30 baktériumtörzs (18 baktériumfaj: Bacillus clausii, B. subtilis, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus​, L. delbruckii supsp. bulgaricus, L. helveticus, L. lactis subsp. lactis​, L. paracasei, L. plantarum​, L. reuteri​, L. rhamnosus, L. salivarius​, Streptococcus thermophilus​) kultiválását, szelekcióját, továbbá a vizsgált baktériumtörzsek identifikációját MALDI-TOF tömegspektrométerrel, végül harmadik generációs szekvenálási technológia, azaz Oxford Nanopore MinION génszekvenáló eszköz segítségével szekvenáltunk, a rezisztencia gének feltérképezhetősége és lokalizációjának meghatározása érdekében. Eredményeink alapján kromoszómán kódolt aminoglikozid (AAC(6')-Ii; ANT(4')-Ia), béta-laktám (blaR1), klóramfenikol, makrolid (msrC; Erm(34)), mupirocin, rifampicin, streptogramin A (vatE), tetraciklin (tetW) rezisztenciáért, multirezisztenciáért (clbC) felelős, és multidrog eflux pumpát kódoló (efmA gén) géneket találtunk. Plazmidon kódolt rezisztencia géneket nem detektáltunk. Összességében elmondható, hogy az ellenálló baktériumtörzsek gyógyászati alkalmazása, majd a kolonizáló populációk tartós jelenléte jelentős egészségügyi kockázatot hordozhat, mivel nehezítheti bizonyos fertőzések kezelését, vagy immunhiányos betegek esetében fertőzések kialakulásához vezethet.

Témavezető: Dr. Papp Dalma

A termogén aktivitást mutató barna adipociták nagy mennyiségben használnak fel metabolikus szubsztrátokat, például glükózt, zsírsavakat és aminosavakat. Az elágazó-láncú aminosavak (BCAA-k) az SLC25A44 transzporter közvetítésével jutnak be a mitokondriumokba, ahol oxidációjukat követően az uncoupling protein 1 (UCP1) által biztosított protonszivárgás révén szolgáltatnak energiát a hőtermeléshez. Ez az elhízás ellen ható folyamat gyorsan aktiválódik hideg indukált adrenerg jel hatására, melyet intracellulárisan a cAMP-vezérelt jelátvitel szabályoz. Míg a sejtmembránon keresztüli glükóz- és zsírsav-transzport folyamata részletesen feltárt (például GLUT4 és FATP1 révén), addig a különböző aminosavak adipocitákba történő felvételének mechanizmusa még nem teljesen tisztázott.Korábban megfigyeltük, hogy az L-aminosav transzporter (LAT) 1 farmakológiai gátlása, valamint siRNS-alapú csendesítése csökkentette a termogenezist humán primer adipocitákban. A Simpson-Golabi-Behmel szindrómában (SGBS) szenvedő betegből származó preadipocita sejtvonal értékes modellrendszernek bizonyult a humán adipociták sejtbiológiai folyamatainak tanulmányozására. Jelen vizsgálatunk célja a LAT transzporter család szerepének feltárása volt SGBS adipocitákban, különös tekintettel az aktív hőtermelő folyamat során.Az SGBS preadipocitákat 14 napig differenciáltattuk fehér (ADIP) és barna (B-ADIP, hosszú távú roziglitazon-kezelés révén) adipocitákká, majd a sejteket LAT1 specifikus gátlószerrel (KYT-0353), LAT család elleni inhibitorral (BCH), illetve dibutiril-cAMP-vel (db-cAMP), valamint ezek kombinációival kezeltük 10 órán keresztül. A termogén gének mRNS- és fehérje-szintű expresszióját RT-qPCR-rel és western blottal vizsgáltuk. A sejtek metabolikus aktivitását (oxigén fogyasztás és extracelluláris acidifikáció) Seahorse XF Pro Metabolic Analyzer segítségével határoztuk meg. A mérés során etomoxirt és oligomycint alkalmaztunk az aminosav fogyasztással összefüggő etomoxir-rezisztens és a hőtermeléssel arányos protonszivárgásos légzés számszerűsítésére.Eredményeink alapján mind a LAT család mind a LAT1 gátlása csökkentette a BCAA-fogyasztást, az etomoxir-rezisztens és a protonszivárgásos légzést, valamint a termogén markerek (pl. UCP1, PGC1α) expresszióját humán SGBS adipocitákban, a db-cAMP-vel stimulált állapotban. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a LAT család funkciója elengedhetetlen az SGBS adipociták effektív hőtermeléséhez adrenerg jel általi termogenikus aktiváció során.

Témavezető: Dr. Kristóf Endre Károly és Dr. Arianti Rini