A biológiai óra rendellenes működése a daganatos transzformáció ismert kísérőjelensége, amely szoros összefüggést mutat a sejtciklus zavaraival és a metabolikus átprogramozódással. A perifériás órákat nemcsak a fény-sötét ciklus, hanem a tápanyag-elérhetőség ritmusa is befolyásolja. Bár a melanóma irodalmában rendelkezünk adatokkal a biológiai ritmus zavaráról, mégis kevéssé ismert, hogy a daganatsejtek sérült ritmicitása visszaállítható-e külső, metabolikus szinkronizációval (éheztetés), és hogy ez a válaszkészség változik-e a betegség progressziójával.Vizsgálatainkban humán epidermális melanocitákat, valamint korai (in situ, WM35) és invazív (A2058) melanóma sejtvonalakat hasonlítottunk össze. A sejteket 24 órás éheztetéssel szinkronizáltuk, majd 48 órás időablakban 8 óránként RNS és fehérje mintákat vételeztünk. A sejtek éheztetéséhez speciális sejttenyésztő médiumot, a SILAC RPMI 1640 Flex mediumot (glükóz, piruvát, HEPES, fenolvörös, L-arginin, L-glutamin és L-lizin nélkül) alkalmaztuk. Az óragének (BMAL, CLOCK, PER, CRY, REV-ERB, RORα) mRNS expresszióját RT-qPCR-rel, míg a fehérje expresszió oszcillációját western blot technikával határoztuk meg. Az adatok ritmicitását és trendjeit a nem-parametrikus RAIN algoritmussal értékeltük.Az mRNS expressziós adatok elemzése alapján a daganatos átalakulás jelentős változásokat idézett elő, amely leginkább a ritmicitás zavarában valósult meg. A ritmuszavart a metabolikus szinkronizáció sem volt képes minden esetben korrigálni, a BMAL2 és RORα gének oszcillációja mindkét melanóma típusban, az éheztetés ellenére is hiányzott. Az mRNS és fehérjeszintek összevetése jelentős fáziseltolódást mutatott, ami a poszt-transzkripciós szabályozás zavarára utal. A legfontosabb különbség azonban a két daganattípus metabolikus válaszkészségében mutatkozott. Míg az invazív A2058 sejtek ritmusa rezisztensnek bizonyult az éhezés okozta metabolikus stresszre, addig a korai stádiumú WM35 sejtekben a tápanyagmegvonás képes volt korrigálni a zavart biológiai órát számos kulcsgén (PER3, CRY2 és REV-ERB) elvesztett ritmicitásának helyreállításával.Eredményeinkkel igazoltuk, hogy a melanóma progressziója során a biológiai óra elveszti metabolikus plaszticitását. A korai stádiumú daganatsejtek zavart működésű biológiai órája érzékeny a tápanyagmegvonásra, míg az invazív stádiumban ez az összefüggés már nem figyelhető meg. Ezen stádiumfüggő különbségek új szempontokat vetnek fel a jövőbeli kronoterápiás stratégiák tervezésében.

Témavezető: Dr. Hajdú Tibor és Katona Éva

Elméleti bevezető: A nukleáris receptorok (NR) a transzkripciós faktorok egy speciális csoportja, melyek ligandfüggő módon szabályozzák célgénjeik kifejeződését, így a génexpresszió szabályozásában fontos szerepet játszanak. A NR-ok a lipidoldékony ligandjukon keresztül közvetített jel által direkt módon befolyásolják a transzkripciót. A D-vitamin receptor (VDR) ezen intracelluláris receptorok közé tartozik. Génje a humán szervezet számos különböző sejtjében jelen van, mint például a B-és T-sejtekben, a makrofágokban, a prosztata hámsejtjeiben vagy a máj csillagsejtekben. Ligandja a kalcitriol, vagyis a hormonok közé tartozó D-vitamin, ami a szervezetben hidroxilációval keletkezik kolekalciferolból. A humán szervezetben több mint 600 D-vitaminra reagáló gént azonosítottak, melyek közül 179 gén esetében a VDR a válaszközvetítő receptor. A különböző sejttípusokban megtalálható D-vitamin receptorok száma, valamint a nagy mennyiségű célgén azt mutatja, hogy a VDR számos élettani folyamat szabályozásában vesz részt, így kutatási szempontból fontos célterület. Célkitűzés: A kutatásunk célja nagy tisztaságú, fluoreszcens fehérjével („Blue Fluorescent Protein” - BFP) jelölt VDR fehérje termelése, a megtermelt fehérje vizsgálata fluoreszcens mikroszkópiás módszerekkel, és a magreceptorok kölcsönhatásainak tanulmányozása a VDR és a munkacsoportunk által korábban előállított további rekombináns magreceptorok között.Módszerek: A BFP-VDR fehérjét kódoló expressziós vektort molekuláris klónozással hoztuk létre, majd a plazmid vektort a „Single-Step” „KRX” kompetens sejtekbe transzformáltuk fehérjetermelés céljából. Az inklúziós testekből két körös szonikálással szabadítottuk fel a célfehérjét, majd nikkel-kelát affinitáskromatográfiával és gélextrakcióval tisztítottuk. A tisztított fehérjét gélelektroforézissel, Western-blot analízissel és fluoreszcens korrelációs spektroszkópiával elemeztük.Eredmények: A folyamat során molekuláris klónozást végeztünk, amellyel előállítottuk a fehérjetermeléshez használható plazmidot. A vektor összetételét kapilláris szekvenálással ellenőriztük. A „Single-Step” „KRX” sejtekben a BFP-VDR fehérjét a tisztítási lépésekhez elegendő mennyiségben termeltük meg, majd az affinitáskromatográfiás és gélextrakciós tisztítások eredményeként a fluoreszcens mikroszkópos mérésekhez használható, megfelelő tisztaságú rekombináns magreceptor fehérjét állítottunk elő.

Témavezető: Hagymási-Szabó Zsófia és Dr. Vámosi György

A makrofágok (MF) sokoldalú immunsejtek, amelyek alapvető szerepet játszanak a védekezésben, a homeosztázis fenntartásában és a szervezet folyamatos ellenőrzésében. Szöveti lokalizációjuktól és a mikrokörnyezet ingereitől függően eltérő funkcionális fenotípusokat mutatnak. A makrofágok működése nagymértékben támaszkodik a mintázatfelismerő receptorokra (PRR-ekre), melyek kulcsszerepet töltenek be a kórokozó- és károsodás-asszociált molekuláris mintázatok (PAMP-ok és DAMP-ok) felismerésében. A Nod-like receptorok intracelluláris PRR-ek, melyek expressziós profilja függ a sejtek polarizációs állapotától, és dinamikusan változhat a sejtek aktivációját követően. Az NLR-ek családjába tartozó NLRP1 inflammoszóma fehérjekomplex kialakítására képes, mely fontos szerepet játszik az IL-1β/IL-18 citokinek termelésében. Munkánk során különböző humán makrofágok NLRP1 inflammoszóma expressziójának és aktivitásának összehasonlító vizsgálatát tűztük ki célul.A makrofágokat humán vérből izolált monocitákból differenciáltattuk különböző citokinek jelenlétében (a) gyulladásos, (b) regenerációs és (c) agyi makrofág/mikroglia sejtekké. A sejtekből qRT-PCR és Western blot módszerrel határoztuk meg az NLRP1 expresszióját, a sejtek felülúszójából pedig ELISA módszerrel mértük a citokinek szekrécióját. Az NLRP1 csendesítését siRNS felhasználásával végeztük.Eredményeink szerint bár mindegyik makrofág alpopuláció kifejezte az NLRP1-et, jelentős különbségeket tapasztaltunk az expresszió mértékében mind kezeletlen, mind aktivált sejtekben. Ezen kívül jelentős különbségeket mértünk az IL-1β és IL-18 citokin szekréció dinamikájában és mennyiségében a különböző makrofág altípusok között az NLRP1 inflammoszóma aktiválását követően. Az NLRP1 további funkcionális vizsgálatához pedig sikeresen beállítottuk az siRNS-sel történő csendesítését. A projekt pénzügyi hátterét az NKFIH K-147109 számú pályázat biztosította.

Témavezető: Dr. Benkő Szilvia és Ahmad Hala

Adrenergic-driven thermogenic activation of brown adipose tissue (BAT) requires high amounts of nutrients including iron supporting mitochondrial biogenesis. We found that this was regulated by rapid gene expression changes in human brown adipocytes. Global transcriptomic analysis showed that the expression of genes encoding transferrin receptor 1 (TFRC) and melanotransferrin (MELTF) iron transport-related proteins was induced by adrenergic stimulation. Meanwhile, transferrin (TF) expression was constantly high and enriched in the adipocyte cluster within human BAT. Therefore, we aimed to unravel the involvement of iron regulatory pathway in thermogenic activation of adipocytes.Stromal vascular fraction was isolated from subcutaneous white adipose tissue (WAT) and deep cervical BAT biopsies, which were obtained from patients undergoing thyroid surgery. Next, preadipocytes were differentiated to matured adipocytes by using adipogenic cocktail for 14 days. TFRC was knocked down by siRNA-mediated interference for 48 hours. To mimic in vivo thermogenesis, adipocytes were treated with dibutyryl-cAMP for 10 hours. Intracellular iron level was measured by applying a colorimetric assay. The effect of TFRC silencing on thermogenic gene expression was investigated by RT-qPCR and western blot. The oxygen consumption rate of adipocytes was measured by Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer. The amount of TF and MELTF secreted into the conditioned media was assessed by ELISA. Finally, adiposetissue.org database was used to analyze the correlation between TF or MELTF expression in human WAT with clinical parameters.TFRC knock-down during adrenergic activation decreased intracellular iron content and prevented the elevation of oxygen consumption and induction of thermogenic markers. Brown adipocytes constitutively secreted high amounts of TF while the released MELTF at activated condition was predicted to further augment iron uptake stimulating heat production. Protein-protein interaction in silico analysis showed that MELTF has an ability for binding to TFRC due to its high degree of homology with TF. The expression of iron binding proteins in WAT positively correlated with measures of metabolic health. These findings suggest that TFRC-mediated iron influx is essential for efficient thermogenic activation in human adipocytes, supported by constant release of TF along with strong MELTF upregulation which potentially serves as an auxiliary modulator of TFRC function.

Témavezető: Dr. Kristóf Endre és Dr. Arianti Rini

Sarcopenia is a progressive, generalized skeletal muscle disorder characterized by a decrease in muscle mass and functional decay, accompanied by reduced muscle strength. Its development can be influenced by numerous factors, including environmental factors, inflammatory pathways, mitochondrial dysfunction, damage to neuromuscular junctions, and a decreased number or abnormal activation of skeletal muscle stem cells. Our research group has previously demonstrated that the expression of tissue transglutaminase (Tgm2) increases during the aging of skeletal muscle stem cells, and the young Tgm2-deficient (KO) mice have smaller muscle fibers than their wild-type (WT) counterparts. These findings suggest that Tgm2 can play a protective role against sarcopenia. In our current work, we characterize the tibialis anterior, extensor digitorum longus (EDL), and the soleus muscles of aged Tgm2 WT and KO mice, assessing their physical performance, fiber diameter, and the expression of sarcopenia-related genes. Our results indicate that in the absence of Tgm2, not only the size of muscle fibers but also the muscle mass decreases, and the levels of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6) increase. Interestingly, when examining muscle performance, Tgm2-deficient EDL muscles, but not the soleus, activate more rapidly and fatigue more slowly than the wild-types. Altogether, these findings indicate that Tgm2 has a complex role in the regulation of aging skeletal muscle.

Témavezető: Dr. Sarang Zsolt és Papp Albert Bálint

Background: SGLT2 inhibitors and metformin are widely used in the treatment of type 2 diabetes and are generally well tolerated, but many patients report gastrointestinal (GI) symptoms, such as constipation. Although these effects are mild, diabetic therapy is long-term, and even small discomforts can accumulate over time and reduce adherence. Metformin activates AMP-activated protein kinase (AMPK), mainly through inhibition of mitochondrial complex I, but most evidence comes from cardiac muscle. Whether similar AMPK-dependent mechanisms operate in intestinal smooth muscle remains unclear. AMPK activation by SGLT2 inhibitors is less well established. Some studies show that canagliflozin can activate AMPK, and emerging data suggest that dapagliflozin may increase the p-AMPK/AMPK ratio. Because AMPK inhibits myosin light-chain kinase (MLCK) and lowers myosin light-chain (MLC) phosphorylation, this signaling axis may contribute to reduced intestinal contractility and treatment-related GI disturbances.Methods: Murine intestinal smooth muscle segments were mounted in organ baths to record spontaneous and carbachol-induced contractile activity after treatment with dapagliflozin or metformin, with or without the AMPK inhibitor dorsomorphin. Modulation in basal tone, integral force, amplitude, and frequency were measured. AMPK activation was assessed by p-AMPK ELISA, and MLC phosphorylation by Western blot.Key results: Differences in basal contractility after dapagliflozin or metformin treatment did not reach statistical significance; however, consistent numerical trends were observed. Baseline integral values were lower in tissues treated with either drug compared with the control, and carbachol-induced responses showed a blunted dose–response pattern. Pretreatment with dorsomorphin partially restored these parameters. At the molecular level, dapagliflozin and metformin increased phosphorylated AMPK, while phosphorylated MLC decreased. In dorsomorphin-pretreated tissues, phosphorylated AMPK was reduced and MLC phosphorylation partially recovered, consistent with the functional rescue in the organ bath experiments. Conclusions & inferences: These findings support a model in which dapagliflozin and metformin reduce intestinal contractility through AMPK activation and downstream inhibition of the MLCK–MLC pathway. This mechanism may underlie the GI disturbances reported with these drugs and inform strategies to improve long-term adherence.

Témavezető: Dr. Docsa Tibor és Dr. Uray Karen Lee

The gut microbiome influences host physiology both by exerting local effects and through the absorption of bioactive metabolites into the blood circulation to reach distant organs, such as the small intestine. Indoxyl sulfate (IS), which is synthesized by gut microbiota during tryptophan metabolism, has been extensively studied in renal and cardiovascular disorders, but its role in intestinal motility is poorly defined. Therefore, we aimed to study the effect of IS on the contractile activity of the small intestine. The ex vivo spontaneous and agonist-induced contractile activity in intestinal strips was measured after treatment with IS at the concentrations approximating blood circulating levels. In addition, changes in the calcium sensitivity of intestinal contractile activity were measured. To define the signaling pathway by which IS acts, pregnane X receptors (PXR) and aryl hydrocarbon receptors (AhcR) antagonists were tested during agonist-induced contractions. The IS-induced changes in intracellular calcium in the primary human intestinal smooth muscle cells (HISMCs) were measured using FURA 2-AM fluorescence assay. Our findings showed that IS significantly inhibited agonist-induced contractile activity compared with vehicle (DMSO) treatment. After calcium depletion, contractile activity increased significantly with increasing calcium concentrations in the vehicle-treated intestinal strips but not in the IS-treated intestinal strips, indicating that IS affected calcium sensitivity. Treatment with a PXR antagonist but not AhcR antagonist blocked IS-induced inhibition of agonist-induced contractile activity. The fluorescence assay showed that IS increased intracellular calcium in a dose-dependent manner. These results demonstrate that IS inhibits agonist-induced intestinal motility via PXR receptors and potentially via altered influx/efflux of calcium. The disruption of calcium-dependent intestinal contractions by IS could affect gut motility and may affect nutrient absorption and gastrointestinal health.

Témavezető: Dr. Uray Karen Lee

Splicing factor proline- and glutamine-rich (SFPQ) is an essential RNA-binding protein (RBP) with diverse nuclear functions. In neurons, tight regulation of SFPQ is particularly important, as altered SFPQ function or mislocalization has been implicated in several neurodegenerative diseases. These alterations are often linked to changes in gene expression or in the phosphorylation state of SFPQ. TIMAP (TGF-beta-inhibited membrane-associated protein) is a regulatory subunit of protein phosphatase 1 (PP1). Our earlier work identified SFPQ as a nuclear interacting partner of TIMAP. Pathway enrichment analysis of transcriptomic changes following TIMAP depletion in SH-SY5Y cells revealed significant enrichment of processes associated with neuronal morphogenesis, projection development, and neuronal differentiation, all of which are biological functions in which SFPQ has well-established functions. SFPQ has reported phosphorylation sites at S8, S283, and T687, suggesting it may be regulated by the TIMAP-PP1c phosphatase complex. Our aim was to investigate whether the TIMAP-PP1c phosphatase complex regulates SFPQ through phosphorylation.Interaction between SFPQ and the TIMAP-PP1c complex was verified by pull-down assay, using recombinant PP1c and TIMAP proteins, and additionally, by immunoprecipitation of SFPQ from SH-SY5Y. Next, we have cloned the SFPQ coding sequence into pCMV-HA mammalian expression vector, and using site directed mutagenesis, T687A phosphonull and T687D phosphomimic mutants of SFPQ were created. TIMAP depleted (shTIMAP), and pLKO control (shCTR) SH-SY5Y cells were transfected with wild-type and phosphomutant SFPQ encoding plasmids using Lipofectamine 3000 reagent. Western blot analysis in both cell lines confirmed the overexpression of all the recombinant proteins. Since the phosphorylation state of SFPQ can influence its subcellular localization, we performed immunofluorescent staining on transfected shCTR and shTIMAP cells. Confocal microscopy revealed differences in the subcellular distribution of the SFPQ mutants, which will be further evaluated by cell fractionation.In conclusion, we validated that the TIMAP-PP1c phosphatase complex interacts with SFPQ and successfully created wild-type and T687 phosphomutant SFPQ clones, which can be used to explore the potential role of this complex in regulating SFPQ. This project was funded by the National Research, Development and Innovation Fund of Hungary (FK135384 (A.B.).

Témavezető: Dr. Boratkó Anita és Fonódi Márton