OETDK.

A raktár-vezérelt kalcium belépés (SOCE) során az endoplazmatikus retikulum (ER) kiürült Ca2+-raktárai által közvetített jelek a Ca2+-ok sejtbe való belépését, majd a raktárak újratöltését eredményezik. Az ER membrán STIM1 fehérjéje és a plazmamembrán Orai1 Ca2+-csatornája közötti kapcsolat meghatározó a folyamatban. Hipotézisünk szerint a gyors átrendeződésre képes, citoszkeletális septin fehérjék a két molekula közötti kapcsolat stabilizálása révén elengedhetetlenek a SOCE-hoz. Korábbi kísérleteinkkel már igazoltuk a septinek és a SOCE funkcionális viszonyát melanóma sejtekben, ezért jelen munkánk célja, hogy humán epidermális melanocitákban vizsgáljuk meg a jelenség daganatos fenotípussal való összefüggését.Kísérleteinkhez általunk humán bőrből izolált primer epidermális melanocita kultúrákat használtunk. A septinek és a SOCE-ban érintett molekulák mRNS illetve fehérjeexpressziójának vizsgálatához új generációs szekvenálást (NGS), valamint western blotokat végeztünk. Ezután a septinek SOCE-ban betöltött szerepét a septin polimerek dinamikus átrendeződésének farmakológiai befolyásolásával (200 μM forchlorfenuron [FCF]), valamint a SEPTIN7 siRNS-sel történő géncsendesítésével vizsgáltuk. Az FCF kezelések szignifikáns csökkenést eredményeztek a sejtek MTT assay-vel vizsgált mitokondriális aktivitásában (életképességében). A SEPTIN7 tranziens transzfekcióját sikeresen optimalizáltuk a melanocitákban, amelynek sikerességét RT-qPCR és western blot segítségével alátámasztottuk. Az FCF kezelés, illetve a SEPTIN7 géncsendesítés SOCE-ra kifejtett hatásainak feltérképezéséhez a melanocitákat Fura2-vel töltöttük és CoolLED (340-380 nm) gerjesztés mellett inverz mikroszkóppal vizsgáltuk. Méréseink az FCF-fel kezelt és az siRNS-sel csendesített sejtekben is igazolták a SOCE amplitúdójának és meredekségének csökkenését, ami alátámasztja a septinek szerepét az epidermális melanociták SOCE-jában. A SEPTIN7 csendesítése azonban kevésbé markánsan érintette a SOCE-t a melanocitákban, mint melanóma sejtekben. A transzfekciót követő NGS és az eredmények transzkriptomikai elemzése jelenleg még folyamatban van.Eredményeinkkel igazoltuk, hogy a melanóma sejtekhez hasonlóan a SOCE az egészséges pigmentsejtekben is septin-dependens, azonban a melanocitákban a SEPTIN7 kevésbé esszenciális, mint a melanóma sejtekben, azaz a SEPTIN7 szerepe összefügghet a daganatos fenotípussal és érdekes új célpontként szolgálhat a melanóma kezelésében.

Témavezető: Dr. Hajdú Tibor és Dr. Fodor János

A PACAP egy, a hipotalamuszban termelődő neuropeptid, amely jelen van a központi idegrendszerben és több perifériás szövetben is. Igazolták, hogy kedvezően befolyásolja az in vivo porcképződést, továbbá hiánya megváltoztatja az ízületi porc egyes komponenseinek expresszióját. A PAC1 receptor aktiválásával a neuropeptid a porcképződés szempontjából kulcsfontosságú PKA útvonalat aktiválja, amely porcspecifikus transzkripciós faktorok nukleáris transzlokációját idézi elő, ugyanakkor esetleges szignalizációs kapcsolatai nem teljesen feltérképezettek. Kutatásaink során olyan modellrendszert dolgoztunk ki, amely lehetővé teszi a végtagfejlődés korai lépéseinek in vitro vizsgálatát, és ezáltal a PACAP hatásainak tanulmányozását a hedgehog (HH) jelátvitelre vonatkozóan is. Négy napos csirkeembriók végtagtelepeit mikroszkóp alatt izoláltuk, majd szövethálóra helyeztük. A végtagbimbók vágott felszínéről a sejtek 48 órán belül belenőttek a hálóba, és megfelelő körülmények között a végtagok fejlődésnek indultak. A szövetkultúrákat három héten keresztül tartottuk fenn, ez idő alatt kétnaponta PACAP 1–38, PACAP 1–27 és PACAP 6–38 kezeléseket alkalmaztunk. A tenyésztés végén a mintákat paraffinba ágyaztuk és immunhisztokémiai vizsgálatokkal konfokális mikroszkópban nyomon követtük a CREB, P-CREB, Sox9, P-Sox9, IHH és PTHrP szubcelluláris lokalizációját. Ezen kívül megvizsgáltuk a II-es típusú kollagén, valamint a hialuronsav (HA) expresszióját. Kísérleteink során a PACAP 1-27 jelentős HA termelés fokozódást eredményezett. A II-es típusú kollagén termelése emelkedett a PACAP 1-27 kezelt végtagbimbókban, míg a többi csoportban nem mutatott szignifikáns változást. A Sox9, P-Sox9, CREB és P-CREB nukleáris lokalizációja meglepő módon nem változott vagy inkább csökkent a PACAP variánsok alkalmazása közben. Ezzel ellentétben az IHH és a PTHrP expressziója lényeges változásokat mutatott PACAP 1-27 jelenléteben. Ezek alapján feltételezzük, hogy a PACAP 1–27 a hedgehog útvonalak aktiválásán keresztül befolyásolja a végtagfejlődést és az enchondralis csontosodást. Támogató: NKFIH K139396

Témavezető: Dr. Juhász Tamás és Fillér Csaba

A vázizom összehúzódása az elektromechanikai kapcsolat (EC coupling) folyamatán alapul, amelyben a neuromuszkuláris junkción keresztül az izomrostra érkező akciós potenciál beterjed a T-tubulusokba, ahol a membrán depolarizációja konformációváltozást idéz elő az L-típusú feszültségérzékeny kalciumcsatornákban (DHPR/CaV1.1). Ez a feszültségérzékelő domének mozgásán keresztül mechanikusan aktiválja a RyR1 receptorokat, amelyek Ca²⁺-felszabadulást váltanak ki a szarkoplazmatikus retikulumból. A DHPR feszültségérzékelő doménjének mozgása töltésmozgásként regisztrálható, amely nem ionáramot tükröz, hanem az EC coupling első lépésének közvetlen elektromos jele. Így a töltésmozgás vizsgálata segíthet az izomfunkció bizonyos zavarainak megértésében.Kísérleteinkben teljes sejtes patch-clamp technikát alkalmaztunk, amelyben az ionáramok blokkolása mellett a feszültségérzékelő domének által generált kapacitív áramot mértük. A munkám egy jelentős részeként a rekordok kvantitatív analízisére alkalmas szoftvert fejlesztettem, amely precízen izolálja és számítja a töltésmozgást. A növekvő adatmennyiség feldolgozását gépi tanulási módszerekkel támogatjuk, neurális hálózatokra építve. Ezek tanítását folyamatosan végezzük, a manuális analízis adatait használva. Visszajelzésként a modellnek rendszeresen ellenőrizzük és összevetjük az automatizált, illetve manuális analízis eredményeit, így egyre pontosabb kiértékelést érhetünk el. A kísérleteinkben kontroll és az embrionális kori DHPR izoformát expresszáló CaV1.1Δe29 mutáns egerek izolált izomrostjain rögzítettünk áramgörbéket. Ezeket analízisével a mutációval összefüggő EC coupling-eltéréseket kívánjuk azonosítani.

Témavezető: Dr. Dr. Hermanné Dr Dienes Beatrix

Bevezetés: Emberben a szív EKG paraméterei kapcsán a nemi különbségek jól ismertek, de a humánhoz szívelektrofiziológiai szempontból leginkább hasonló kutyában végzett sejtszintű összehasonlító vizsgálatok száma csekély. Ezért célunk az akciós potenciál (AP) nemi különbségeinek feltárása volt kutyából származó bal kamrai szívizomsejteken.Módszerek: Az Élettani Intézet szívelektrofiziológiai munkacsoportban korábban összegyűjtött AP-okat csoportosítottuk a kísérleti állat neme, az aktuálisan felhasznált perfúziós oldat (Krebs, BTY vagy NTY) és az AP alakja alapján besorolt kamrafali elhelyezkedés (endo, mid, epi) alapján. Ezután az AP paramétereit (pl. az AP időtartama 20,50,75 és 90%-os repolarizációnál (APD20,50,75,90), a korai és késői plató fázis (az APD90 20 illetve 50%-ánál) membránpotenciálok (Plateau20, Plateau20 amplitúdó (AMP), Plateau50, Plateau50 AMP) és a nyugalmi membránpotenciál (RMP)) a megfelelő statisztikai próbákkal vizsgáltuk nemi különbségeket keresve.Eredmények: Mid sejtekben (n=143 kan és 136 szuka) az alábbi szignifikáns különbségeket tapasztaltuk (átlag±standard hiba): Plateau50 (kan: –12±1, szuka: –7±1 mV); Plateau50 AMP (kan: 71±1, szuka: 78±1 mV); APD75 (kan: 222±3, szuka: 213±2 ms); APD90 (kan: 233±3, szuka: 223±2 ms); APD50/APD90 (kan: 0,81±0,01, szuka: 0,82±0,01). A perfúziós oldat alapján összehasonlítva a kan illetve szuka eredetű sejteket, akkor a szignifikancia kizárólag a Plateau50 AMP esetében Krebs oldatban volt megfigyelhető (kan: 61±1 (n=72) és szuka: 69±2 mV (n=54)). Szignifikáns RMP különbség csak a Krebs és NTY oldatban volt, ahol enyhén negatívabb érték jellemezte a szuka eredetű sejteket.Epi sejtekben perfúziós oldattól független elemzésben (n=30 kan és 45 szuka) az alábbi különbségeket tapasztaltuk: Plateau20 kan: 12±1, szuka: 7±1 mV; APD20 kan: 87±6, szuka: 54±6 ms; APD50 kan: 167±5 ms, szuka: 154±4 ms; APD50/APD90 kan: 0,79±0,01, szuka: 0,76±0,01; RMP kan: –82±1, szuka: –84±1. Az APD50 értéke NTY oldatban (n=17 kan és 18 szuka) is magasabb volt kan eredetű sejteken.Endo sejtekben (n=33 kan és 47 szuka) nem tapasztaltunk nemi különbségeket.Megbeszélés: Az emberhez hasonlóan azt vártuk, hogy az akciós potenciál szukákból származó sejteken hosszabb, de pont ellenkezőleg, a hímekből származó sejtekben volt nagyobb az APD75 és APD90 értéke, igaz csak a perfúziós oldattól független elemzésben. A nemi különbségek további vizsgálata pl. egyedi ionáramok szintjén is indokolt.Támogatás: NKFIH-K142764

Témavezető: Dr. Szentandrássy Norbert és Dr. Kovács Zsigmond Máté

A vaszkuláris kalcifikációt korábban passzív folyamatnak tartották, azonban ma már egyértelmű, hogy ez egy aktív, sejtek által mediált folyamat. A vaszkuláris kalcifikáció a vaszkuláris simaizomsejtek (VSMC-k) oszteo-kondrogén differenciációjának következménye. E differenciáció során a VSMC-k elveszítik sejt-specifikus markereiket, és oszteoblasztszerű fenotípust öltenek. Ezt elsősorban olyan oszteogén transzkripciós faktorok irányítják, mint a RUNX2, SOX9, BMP2 és MSX2, amelyek különféle oszteoblaszt-szerű fehérjék transzkripcióját szabályozzák. Az oszteogén transzdifferenciáció több kiváltó tényezőjét is azonosították, például a magas szervetlen foszfátszintet, amely felgyorsult mineralizációhoz vezet krónikus vesebetegségben szenvedő betegeknél, illetve a magas glükózszintet, amely fokozott mineralizációval jár 2-es típusú cukorbetegség esetén. Nemrégiben kimutattuk, hogy a hipoxia-indukálta faktor (HIF) útvonal aktivációja elősegíti mind a VSMC-k, mind a billentyű-intersticiális sejtek (VIC-ek) oszteo-kondrogén differenciációját, ezáltal előmozdítva a vaszkuláris, illetve a billentyű kalcifikációját.Ebben a projektben azt kívánjuk vizsgálni, hogy a HIF-aktiváció összefüggésben áll-e a VSMC-k és VIC-ek anyagcsere-változásaival, valamint hogy az anyagcsere-eltérések szabályozzák-e az oszteo-kondrogén differenciáció folyamatát. Humán aortából származó VSMC-ket és VIC-eket használva tanulmányozzuk a különböző hipoxiás és pszeudo-hipoxiás jelek hatását a különféle metabolitok szintjére. Géncsendesítéssel és specifikus inhibitorok alkalmazásával módosítjuk a különböző anyagcsereútvonalakat annak érdekében, hogy kiderítsük, befolyásolják-e ezek a kalcifikáció folyamatát. Az adeninnel indukált krónikus vesebetegség egérmodellt alkalmazzuk a HIF-aktiváció és az anyagcsere-változások mediális kalcifikációban és billentyűkalcifikációban betöltött szerepének vizsgálatára.

Témavezető: Dr. Jeney Viktória és Dr. Csiki-Tóth Andrea

Az angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) kulcsszerepet játszik a renin–angiotenzin–aldoszteron rendszer működésében, így meghatározó a só-víz háztartás szabályozásában, valamint a kardiovaszkuláris betegségek patogenezisében és kezelésében. A keringő ACE aktivitásának emelkedése emellett a granulomatózus gyulladások – például a szarkoidózis – bevett diagnosztikai markere is. Korábbi eredményeink arra utaltak, hogy a keringő ACE szintje stressz hatására eddig nem ismert módon változhat, ezért vizsgálatunk célja e jelenség részletesebb feltárása volt.Elektív tüdőműtétre váró betegektől (n=45) három időpontban vettünk vérmintát: a műtét előtt egy hónappal, közvetlenül a műtét előtt, valamint a műtétet követően egy hónappal. Minden alkalommal felvettük a Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) kérdőívet. Szérummintákból fluoreszcens kinetikus módszerrel határoztuk meg az ACE- és ACE2-aktivitást, míg a kortizolszintet és a negatív akut fázis fehérjéket klinikai kémiai analizátorral mértük.A szérum kortizol koncentrációja a műtét előtt szignifikánsan megemelkedett a kiindulási értékhez képest (427±226 nM vs. 219±104 nM, p<0,001), jóllehet a HADS kérdőív szorongás- (rendre: 7 vs. 6, p=0,999) és depressziópontszámai (rendre: 4 vs. 3, p=0,380) nem mutattak érdemi változást. A szérum ACE aktivitása közvetlenül a műtét előtt szignifikánsan csökkent a kiindulási értékhez képest (10,7 ± 2,3 U/L vs. 11,8 ± 2,4 U/L, p<0,001), és ezzel a negatív akut fázis fehérjékre jellemző mintázatot mutatta. Ezzel párhuzamosan a meghatározott negatív akut fázis fehérjék koncentrációja is mérséklődött, többek között az albuminé (41 ± 3 vs. 45 ± 2 g/L, p<0,001), a prealbuminé (217 ± 48 vs. 233 ± 49 mg/L, p<0,001) és a transzferriné (2,38 ± 0,4 vs. 2,63 ± 0,4 g/L, p<0,001). Az ACE hatását ellensúlyozó ACE2 aktivitása ugyanakkor nem különbözött szignifikánsan a kiindulási értéktől (33,4±14 mU/L vs. 35,6±14 mU/L, p<0,001). Eredményeink megerősítik, hogy a keringő ACE aktivitása a negatív akut fázis fehérjékhez hasonló dinamikát mutat, és csökken a kortizol szintjének emelkedésével. Ez az összefüggés új szempontot jelenthet az ACE aktivitásának diagnosztikai értelmezésében, és hozzájárulhat a renin–angiotenzin–aldoszteron rendszer stresszhez kapcsolódó szabályozásának mélyebb megértéséhez.

Témavezető: Dr. Fagyas Miklós és Dr. Váradi Csongor

Understanding human brain is not fully possible on the basis of experiments on animal tissue; due to the crucial differences between humans and the commonly used experimental animals. It is impossible to employ human brain tissue under physiological conditions, therefore, the use of „quasi-control” tissue obtained from neurosurgical operations is invaluable.Only those samples are collected and used for experimental purposes which are not needed for the diagnosis; typically those small tissue pieces the removal of which is inevitable when accessing the tumor during surgery. Ethical approvals and the written agreement of the patient are needed before starting the procedure.In the operating room the neurosurgeon resects the brain specimen and places it to the transport chamber. The transport chamber is filled with oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF) at a temperature between 0–4°C. In order to minimize metabolic activity of the tissue, sodium and calcium concentrations are kept low. For slice preparation, the tissue must be kept in ice-cold cutting solution to be sliced by the vibratome. The thickness is ~300-350 µm, the plane of the slices must be perpendicular to the brain surface for ensuring intactness of greater neurons (as pyramidal cells) for patch clamp experiments. After slicing the tissue must go back to higher temperature which is maintained at ~ 32–34°C for 30 minutes in low sodium aCSF. In the next step, the low sodium aCSF is replaced with aCSF with normal sodium concentration (naCSF) and kept on 18°C. The viability of neurons is evaluated on the basis of morphological and cellular electrophysiological properties.Human brain tissue preparation is an important and crucial step towards Increasing survivability of the tissue and the chances of tissue architure preservation; As a result, the specimen remains as close as possible to its original state. Mastering this step is significant as it ensures reliable and accurate measurements of desired structures.

Témavezető: Dr. Pál Balázs Zoltán és Dr. Hutóczki Gábor